5. Modelos animales
5.2 Modelos animales de diabetes tipo 1
5.2.3 Modelos modificados genéticamente
5.2.3.1 Modelos transgénicos
Los animales transgénicos contienen DNA exógeno adicional en cada célula de su organismo de forma que se transmite de hereditariamente. La inserción del nuevo gen, normalmente produce la expresión de una nueva proteína en células específicas que vendrá determinada por el promotor. Se puede producir también una pérdida de función de genes existentes si la integración del DNA interrumpe algún gen. La técnica más utilizada para la generación de animales trasngénicos es la microinyección de DNA en el pronúcleo masculino. El DNA se insertará de forma aleatoria de forma que algunos individuos lo habrán incorporado en la línea germinal.
5.2.3.1.1 Modelos transgénicos de TCR
Se han aislado clones de célula T de animales pre-diabéticos y diabéticos cuyos TCRs se han utilizado para la producción de TCRs transgénicos en ratones de varios fondos genéticos. Todos los linfocitos T de estos animales presentan todos el mismo TCR. Una de las limitaciones del uso de estos modelos, es el desconocimiento del antígeno que reconocen los TCRs. El modelo transgénico BDC2.5, cuyo TCR fue generado a partir de un clon de células T específico de un autoantígeno de islote no identificado, desarrolla una insulitis severa a partir de las tres semanas que va seguida de una incidencia de diabetes clínica inferior a la del modelo NOD. El transgén en NOD-SCID, acelera el desarrollo de diabetes con una incidencia del 100%, lo que sugiere que en el NOD normal podría existir algún tipo de mecanismo regulador que impidiese el desarrollo de la enfermedad.
El modelo transgénico 8.3, presenta una aceleración de la enfermedad con un corto periodo de insulitis benigna. El antígeno diana del TCR es la molécula IGRP (islet-specific glucose-6-phosphatase catalytic subunit-related
protein)311. La expresión del transgén en un modelo knock-out para RAG2,
Tabla 7. Modelos transgénicos que expresan TCRs de clones de células T
diabetogénicos
TRANSGÉN INSULITIS DIABETES REF.
BDC2.5 (CD4)
↑
↓
3128.3 (CD8)
↑
↑
3135.2.3.1.2 Modelos transgénicos de moléculas de MHC
Una de las características genéticas del modelo NOD es la carencia de la molécula I-E y se ha demostrado que la expresión transgénica de I-E en este ratón puede prevenir la enfermedad. Cuando sólo se expresa transgénicamente una de las cadenas de la molécula I-Ak, la enfermedad no se previene, lo que indica que la sustitución de una serina por un ácido aspártico en la posición 57 de la cadena I-A beta no es suficiente para prevenir la enfermedad. Al expresar transgénicamente las dos cadenas de la molécula I- Ag7, fuertemente ligada a la enfermedad, por la molécula I-Ak la incidencia de DT1 disminuye.
Tabla 8. Modelos transgénicos de moléculas de MHC
TRANSGÉN INSULITIS DIABETES REF.
Eαd
↓
↓
314 Aαk= =
315 Aβk= =
315Aαk Aβk (I-Ak)
↓
↓
316
5.2.3.1.3 Modelos transgénicos de citocinas
El primer gen de citocinas en insertarse en el genoma murino bajo el control del promotor de la insulina fue el IFN-gamma326. La expresión transgénica de citocinas, confiere un papel patogénico a IL-2, IL-10 y los IFNs tanto de tipo I como II, mientras que IL-4, IL-6 y TGF-beta tendrían un papel protector317. Algunas citocinas como TNF-alfa tienen efectos variables en función del la edad a la que se expresa: en animales neonatales promueve una aceleración de la enfermedad potenciando la presentación de autoantígenos a células T autoreactivas, mientras que la expresión en adultos se asocia a una disminución de las células CD8 citotóxicas y sus funciones en los islotes.
Tabla 9. Modelos transgénicos de citocinas
TRANSGÉN INSULITIS DIABETES REF.
IL-2
↑
↑
318 IL-4↓
↓
319 IL-6↑
↓
320, 321 IL-10↑
↑
322 TNF-alfa↑
o↓
↑
o↓
323,324 TGF-beta↓
↓
325 IFN-gamma↑
↑
326,327 IFN-alfa↑
↑
328 IFN-beta↑
↑
329,330 IFN-kappa↑
↑
3315.2.3.1.4 Modelos transgénicos de autoantígenos
La expresión transgénica de proinsulina bajo el promotor de MHC de clase II previene la aparición de diabetes por la expresión de este autoantígeno en el timo, de forma que permite una correcta selección negativa de los linfocitos T específicos para insulina. Esto no ocurre en el caso del GAD, donde la expresión transgénica de GAD65 bajo el promotor de MHC de clase I, no sólo no induce tolerancia sino que aumenta la autoinmunidad frente a los islotes de forma directamente proporcional a la expresión cuantitativa de GAD65, que en condiciones fisiológicas es muy baja332. La expresión de Hsp60 bajo el promotor de clase II en el modelo NOD induce tolerancia frente a los islotes debido a que se expresa en APCs de timo, de forma que se induce tolerancia inmunológica por delección clonal.
Tabla 10. Modelos transgénicos de autoantígenos
TRANSGÉN INSULITIS DIABETES REF.
5.2.3.1.5 Modelos transgénicos de moléculas coestimuladoras
El modelo transgénico que expresa CTLA-4 (CD154) de forma soluble, se une con alta afinidad a las moléculas CD80/CD86 bloqueando la estimulación y provocando una aceleración de la diabetes. La expresión de CD80 en los islotes pancreáticos también acelera la diabetes en el modelo NOD, aunque no produce enfermedad en el fondo genético resistente C57BL/6J, ya que la expresión de esta molécula co-estimuladora por parte de las células beta las convierte en eficientes presentadoras de antígeno y pueden potenciar los procesos autoimmunes.
Tabla 11. Modelos transgénicos de moléculas coestimuladoras
TRANSGÉN INSULITIS DIABETES REF.
CD152 (CTLA-4) ↑ ↑ 280
CD80 ↑ ↑ 336
5.2.3.1.6 Modelos transgénicos de péptidos virales
La tecnología de los transgénicos ha permitido establecer modelos animales que expresan antígenos microbianos en órganos diana de autoinmunidad. En el estudio de la DT1 el modelo más ampliamente utilizado es es ratón que expresa un glicoproteina (GP) del virus de la coriomeningitis linfocítica (lymphocytic choriomeningitis virus, LCMV) bajo el promotor de la insulina de rata: el ratón RIP-GP337,338. En este modelo, un antígeno viral se expresa exclusivamente en las células beta pancreáticas. En ausencia de una activación apropiada, los clones de células T específicos para este antígeno, que no son deleccionados ni en timo ni en periferia, ignoran al antígeno de forma que no se desarrolla diabetes autoinmune. Una sola inmunización con DC que presentan péptidos de la glicoproteína del LCMV, implica una activación de las células T de forma que se produce insulitis pero no diabetes. Si esta inmunización se repite, sí implica el desarrollo de diabetes clínica.
Cuando el ratón RIP-GP se cruza con un modelo transgénico con un TCR específico para LCMV, tampoco desarrolla diabetes espontánea aunque cuando se induce mediante inmunización, aparece de forma acelerada337.
De este modelo original se han desarrollado diferentes variantes con otros ratones transgénicos convencionales, transgénicos inducibles y knock-out para estudiar el papel de diferentes moléculas en este sistema73,339,340.
Existe otro modelo transgénico de péptidos virales que expresa en islotes y timo la nucleoproteína (NP) del LCMV, el ratón RIP-NP. Cuando se inmunizan desarrollan una diabetes de curso muy lento (de tres a seis meses) debido a una baja afinidad de los linfocitos T autoreactivos341.
Tabla 12. Modelos transgénicos de péptidos virales
TRANSGÉN INSULITIS DIABETES REF.
RIP-GP NO NO o acelerada si TCR + inmunización 337,338 RIP-NP NO NO o retrasada si inmunización 341