Taula 2. Concentració d’EGF en teixits i fluids de ratolí Es mostren mitjanes i errors estàndard ND, no detectable Obtingut de Grau i col (109).
3.2. Models experimentals
3.2.1. Estimulació -adrenèrgica crònica
Per a l’estudi de l’estimulació -adrenèrgica crònica ens vam basar en els estudis realitzats anteriorment al nostre laboratori per la Míriam Navarro (244). En el seu estudi, els animals van ser tractats durant 7 o 14 dies amb isoproterenol i va
observar que no hi havia diferències en la inducció d’hipertròfia cardíaca si l’agonista era injectat diàriament o difonia contínuament mitjançant mini-bombes osmòtiques. En el nostre cas, els diferents períodes de tractament van ser de 2, 4, 7 o 14 dies. Durant el tractament, els animals rebien una dosi de 60 mols d’isoproterenol / Kg*dia, distribuïda en dues injeccions subcutànies (a les 09:00h i a les 18:00) de 30 mols mitjançant una solució d’isoproterenol 10,5 mM dissolta en PBS (100 l per un animal de 35 g; corregíem el volum administrat en funció del pes de l’animal). Els animals control eren punxats amb PBS.
En un experiment concret vam voler fer un seguiment més curós dels ratolins sotmesos a l’estrès -adrenèrgic crònic. Per fer-ho, vam utilitzar unes gàbies metabòliques (Tecniplast®, model 3600M021) adaptades per a un sol ratolí. Per tal d’evitar l’estrès que impliquen aquestes gàbies pels ratolins, els animals van passar per un procés d’habituació. Aquest procés va consistir en passar-se 3, 8 i 24 h dins la gàbia metabòlica durant tres dies consecutius. Passats aquests tres dies, es deixava el ratolí a la gàbia comuna durant un dia sencer i al següent es començava l’experiment. Durant l’experiment el ratolí va ser introduït a la gàbia durant el primer, el quart i el setè dia. La resta dels dies els va passar a la gàbia comuna amb altres animals. Els animals d’una mateixa gàbia eren introduïts en diferents gàbies metabòliques el mateix dia. Vam recollir mostres d’orina de 24 h i dades sobre la ingesta de pinso i aigua.
En alguns experiments concrets vam voler estudiar la proliferació cel·lular que tenia lloc als ronyons dels animals sotmesos a una estimulació -adrenèrgica crònica. Per fer-ho vam tractar els animals amb isoproterenol durant 2, 4 i 7 dies. Els animals control van ser tractats amb PBS. Dues hores abans dels sacrifici, els animals van ser punxats intraperitonealment amb una solució de BrdU (Sigma) (150 l d’una solució de 40 mg BrdU / ml d’una solució de NaCl 0,9% i etanol 20%).
3.2.2. Recuperació després de l’estimulació -adrenèrgica crònica
En aquest experiment vam voler observar com es recuperaven els animals després de ser sotmesos a 7 dies d’estimulació -adrenèrgica. Per fer-ho, primerament vam sotmetre els ratolins al tractament amb isoproterenol durant 7 dies. Passats els 7 dies vam parar el tractament. Els animals van ser sacrificats als 0, 2, 7 i 14 dies després d’acabar el tractament. Els animals control van ser punxats amb PBS durant 7 dies i sacrificats tot just acabat el tractament.
3.2.3. Estimulació 1-adrenèrgica crònica
Per a l’estudi de l’estimulació 1-adrenèrgica crònica ens vam basar en els
estudis realitzats anteriorment al nostre laboratori per la Míriam Navarro (244). En el seu estudi, els animals van ser tractats durant 7 o 14 dies amb fenilefrina. En el nostre cas, els diferents períodes de tractament van ser de 2, 7 o 14 dies. Durant el tractament, els animals rebien una dosi de 60 mols de fenilefrina / Kg*dia, distribuïda en dues injeccions subcutànies (a les 09:00h i a les 18:00) de 30 mols / kg mitjançant una solució de fenilefrina 10,5 mM dissolta en PBS (100 l per un animal de 35 g; corregíem el volum administrat en funció del pes de l’animal). Els animals control eren punxats amb PBS.
3.2.4. Sialoadenectomia
En alguns experiments vam voler estudiar la resposta a l’estimulació adrenèrgica en animals als quals havíem extret prèviament les glàndules submaxil·lars (SMG) mitjançant la sialoadenectomia. Eliminant les glàndules submaxil·lars estem eliminat la principal font de síntesi i secreció d’EGF en el ratolí (107).
Per a realitzar aquesta operació, els animals eren anestesiats mitjançant una injecció intraperitoneal de 50 l d’una solució de ketamina (Imalgene 1000®, Merial) / xilacina (Rompún®, Bayer) en una relació 3:1 i diluïda 1/2 en aigua destil·lada. L’ús d’aquest anestèsic (ketamina) combinat amb un relaxant muscular (xilacina) permet la ràpida recuperació dels animals després de l’operació.
A continuació, una vegada l’animal ja es trobava ben adormit, es col·locava sobre una superfície plana en posició supina, immobilitzàvem les quatre extremitats amb cinta adhesiva i realitzàvem una petita incisió al coll per tal d’exposar les glàndules submaxil·lars. Seguidament s’estirava les glàndules cap a l’exterior amb molta cura per tal de poder lligar-les amb un fil; el nus es lligava a nivell dels vasos que irriguen les glàndules, les quals eren immediatament extirpades fent un tall just per sobre del nus. Netejàvem molt bé la ferida amb PBS i aplicàvem un desinfectant com és la sulfanilamida en pols (Kern Farma) per evitar infeccions. Un cop fet això, tancàvem la incisió amb dos o tres punts de sutura, netejàvem les restes de sang amb PBS, aplicàvem de nou sulfanilamida i deixàvem els animals recuperar-se de l’operació sota una font de calor per tal d’evitar la hipotèrmia. Aquests animals sense glàndules submaxil·lars s’anomenaren sialoadenectomitzats (SIALO).
Com a controls dels animals sialoadenectomitzats vam utilitzar un altre grup d’animals als quals vam realitzar una operació simulada. Aquests animals patien una operació en la qual se seguia el mateix protocol que durant la sialoadenectomia, amb la diferència que les glàndules submaxil·lars eren exposades, però ni lligades ni extirpades. Aquests animals els vam anomenar SHAM.
Una vegada realitzades totes les operacions, els animals es posaven en gàbies grans amb una reixeta, per evitar que la ferida es pogués infectar en contacte amb els encenalls. Durant les primeres 24 h es mantenien en dejuni per tal d’uniformitzar les diferències d’ingesta que es donen just després de l’operació. Passades 48 h després de l’operació, els animals començaven a rebre el tractament corresponent.
3.2.5. Estimulació 1-adrenèrgica aguda
En aquest estudi, els animals van rebre una dosi de 30 mols de fenilefrina mitjançant una injecció subcutània d’una solució de fenilefrina 10,5 mM dissolta en PBS (100 l per un animal de 35 g; corregíem el volum administrat en funció del pes de l’animal). Els animals van ser sacrificats a 1, 4, 12 o 24 h després de l’administració. Els animals control no van rebre cap injecció abans de ser sacrificats.
Un altre grup d’animals va ser tractat durant dos dies amb fenilefrina. Passats els dos dies, la meitat dels animals van ser sacrificats, mentre que l’altre meitat van rebre una última dosi de 30 mols de fenilefrina mitjançant una injecció subcutània i sacrificats al cap d’1 h.
En algun experiment, els animals van rebre una dosi de 30 mols de fenilefrina just 30 min després de l’operació de sialoadenectomia, o operació simulada en els controls. L’administració es va realitzar mitjançant una injecció subcutània d’una solució de fenilefrina 10,5 mM dissolta en PBS. Els diferents grups d’animals van ser sacrificats a 1, 4, 12 o 24 h després de la injecció de fenilefrina. Els controls SIALO i SHAM van ser sacrificats 30 minuts després de l’operació.