3 Resultados
3.2 Modificación en la producción de anión superóxido inducida por TOA, MG132 y CAPE
3.2.3 Modificaciones en los niveles de GSH inducidos por TOA y MG132
Como ya se mencionó anteriormente, el GSH constituye una de las defensas antioxidantes más importantes con las que cuenta la célula para evitar el daño oxidativo generado por las ERO. Los niveles intracelulares de esta molécula pueden variar en respuesta a diferentes estímulos
(Pietarinen-Runtti et al., 2000; Xiao et al., 2011). Es por esto que decidimos estudiar de qué manera se ven afectados los niveles intracelulares de GSH en respuesta a los tratamientos en estudio. Para esto, se realizaron ensayos de citometría de flujo utilizando la sonda fluorescente 5-CMF, la cual es capaz de unirse covalentemente al GSH. De la misma manera que se procedió en los ensayos de HE, a partir de los datos obtenidos en las citometrías, se construyeron los correspondientes diagramas de Box-Whisker utilizando las medianas y cuartiles de fluorescencia para los tratamientos individuales y combinados en ambas líneas celulares (Figs. 3.20 y 3.21). En la línea U937 tratada con MG132 durante 6hs, no se observaron grandes cambios en intensidad de señal con respecto al estado basal, mientras que se observó un ligero aumento a 24hs. En el caso de TOA tampoco se observaron cambios importantes a 6hs, aunque luego de 24hs apareció un marcado incremento de los niveles de GSH con respecto al basal. Por último, la combinatoria TOA+MG132 mostró un efecto diferente a los tratamientos individuales, observándose una disminución de GSH a 6hs y un incremento a las 24hs, aunque este último es de menor magnitud que el observado para TOA como droga única a 6hs (Fig. 3.20A). En el caso de CAPE, tanto el tratamiento individual como combinado generaron un leve aumento de los niveles de GSH a 6hs haciéndose este efecto mucho más notorio luego de 24hs (Fig. 3.20B).
_____________________________________________________________________________ 62 Figura 3.20. Cambios en los niveles de GSH inducidos por los tratamientos en U937. Diagramas de Box-Whisker de distribución de fluorescencia obtenidos mediante marcación con 5-CMF para los tratamientos individuales y combinados TOA+MG132 (A) y TOA+CAPE (B) en la línea U937 a 6hs (paneles superiores) y 24hs (paneles inferiores). La escala de fluorescencia se expresa en unidades arbitrarias de fluorescencia (uaf). Control positivo: H2O2 0.5mM. Los gráficos corresponden a un experimento
representativo de todos los realizados. Las CE de todos los tratamientos son las explicitadas en la (Tabla 3.1).
En el caso de la línea Raji, el tratamiento individual con MG132 no provocó cambios apreciables respecto del basal en los niveles de GSH, mientras que para TOA se observó una disminución desde las 6hs de tratamiento que se hizo más marcada a 24hs. Un comportamiento similar al de TOA se evidenció para la combinatoria TOA+MG132 en donde se observó una disminución de la fluorescencia de 5-CMF a 6hs y 24hs de tratamiento (Fig.21A). CAPE generó también una disminución en los niveles de GSH para los dos tiempos ensayados mostrando un comportamiento similar al TOA. Finalmente, si bien para la combinatoria TOA+CAPE se observó una reducción de la señal a 6hs similar a la generada por TOA o CAPE de manera individual, a 24hs de tratamiento se observa una disminución mayor a la generada por cualquiera de las dos
Resultados _____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________ 63 drogas por separado, alcanzando niveles similares a los observados para el control de H2O2
(Fig.21B).
Figura 3.21: Cambios en los niveles de glutatión inducidos por los tratamientos en Raji. Diagramas de Box-Whisker de distribución de fluorescencia obtenidos mediante marcación con 5-CMF para los tratamientos individuales y combinados TOA+MG132 (A) y TOA+CAPE (B) en la línea Raji a 6hs (paneles superiores) y 24hs (paneles inferiores). La escala de fluorescencia se expresa en unidades arbitrarias de fluorescencia (uaf). Control positivo: H2O2 0,5mM. Los gráficos corresponden a un
experimento representativo de todos los realizados. Las CE de todos los tratamientos son las explicitadas en la (Tabla 3.1).
Posteriormente y del mismo modo en que se procedió para los ensayos con HE, se calculó a partir de tres o más experimentos independientes un índice de cambio de fluorescencia de 5- CMF. Esto se realizó para cada uno de los tratamientos ya sean individuales o combinados, con el objetivo de evidenciar en cada caso la presencia de diferencias estadísticamente significativas con respecto al basal en cuanto a los niveles de GSH intracelular (Fig. 3.22).
A partir de dicho análisis puede observarse claramente como el tratamiento individual con TOA en la línea U937, genera una disminución inicial de GSH a las 6hs, que a las 24hs se transforma en un aumento significativo. En el caso de la combinatoria TOA+MG132, si bien se observa una
_____________________________________________________________________________ 64 disminución significativa a 6hs, el aumento posterior es de menor magnitud que el generado por TOA sólo y no supera los niveles basales (Fig. 3.22A, panel superior). Vale la pena recordar que, como se mostró anteriormente, esta combinatoria no indujo niveles significativos de O2.-(Fig.
3.19A, panel superior) y resultó sinérgica en cuanto al efecto citotóxico (Fig. 3.7A).
En el caso de los tratamientos CAPE y TOA+CAPE en U937, se observa que desde las 6hs de tratamiento se genera un aumento significativo delnivel de GSH y que este permanece elevado transcurridas las 24hs (Fig. 3.22B, panel superior). Es necesario señalar que ambos tratamientos inducen la producción de altos niveles de O2.- tanto a 6 como a 24hs según se mostró
anteriormente (Fig. 3.19B, panel superior) y que la combinatoria TOA+CAPE mostró un comportamiento antagónico en cuanto a la inducción de muerte celular (Fig. 3.7B).
Con respecto a la línea Raji, puede observarse que con excepción de MG132, el resto de los tratamientos, ya sean individuales (TOA y CAPE) o combinados (TOA+MG132 y TOA+CAPE) generan una disminución significativa del nivel de GSH intracelular a 6hs que sigue persistiendo a las 24hs de tratamiento (Fig. 3.22A y B, paneles inferiores). Vale la pena recordar que todos estos tratamientos generaron niveles de O2.- significativamente mayores al basal (Fig. 3.19A y B,
paneles inferiores). Además, se hace necesario destacar que tanto TOA+MG132 como TOA+CAPE mostraron antagonismo en la línea Raji (Fig. 3.7C y D).
Esta serie de resultados indica que, en el caso de la línea Raji, aquellos tratamientos capaces de inducir altos niveles de O2.- generan en todos los casos una disminución de GSH sin que se
Resultados _____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________ 65 Figura 3.22. Resumen de los cambios en los niveles de GSH inducidos por TOA, MG132 y CAPE.
Gráficos de barras que muestran el índice de cambio de fluorescencia de 5-CMF con respecto al basal a 6 y 24hs de tratamiento individual o combinado entre TOA y MG132 (A) y TOA y CAPE (B). El índice de cambio (IC) se calculó como: mediana de fluorescencia de 5-CMF inducida por el tratamiento/mediana de fluorescencia de 5-CMF del basal, a partir de los datos obtenidos de tres o más experimentos independientes en cada caso. Control positivo; H2O2 0.5mM. La presencia de diferencias significativas con
respecto al basal se evaluó mediante el Test de Kruskal-Wallis, seguida de un Post-Test de Dunn. * p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. Los valores de CE correspondientes a cada tratamiento se encuentran explicitados en la Tabla 3.1.
Otra es la situación que se presenta en el caso de la línea U937 en donde una mayor producción de O2.-, como ocurre en el caso de TOA+CAPE, genera una respuesta celular que tiende hacia el
aumento de los niveles intracelulares de GSH y esto se asocia a una menor efectividad en cuanto a su capacidad de inducir muerte (antagonismo). Por el contrario, aquellos tratamientos incapaces de causar el aumento significativo de O2.- en esta línea, no generan el aumento de GSH
y esto parece asociarse a un aumento de potencia citotóxica, como ocurre en el caso de TOA+MG132 que presenta un comportamiento sinérgico.
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