Parte II – Moléculas Fisisorbidas
7.4. Modulación electroquímica en SERS Caso a) NB y RH6G
Consideremos en primer término una mezcla de NB (20 nM) y RH6G (40 nM). Realizaremos 20 barridos consecutivos de voltamperometría cíclica en un rango de potenciales de -0.05 a -0.55 V a 0.05 V.s-1 (siendo 20 segundos la duración total de cada ciclo
voltamperométrico). Utilizaremos tiempos de integración de la señal SERS de 1 segundo, de manera de poder seguir la dinámica del proceso. De esta forma, el rango de potenciales aplicados y período (velocidad de barrido) son variables que pueden ser modificadas dependiendo la muestra. Tal como se observa en la Figura 7.2, en esta ventana de potenciales las moléculas de NB son reducidas y oxidadas mientras que las de RH6G comenzarían a reducirse a potenciales cercanos a -0.45 V. La Figura 7.5a muestra el promedio de los 400 espectros SERS de la mezcla, adquiridos durante los 20 ciclos de modulación electroquímica. En el recuadro se resalta la presencia de los picos característicos de NB y RH6G a ̴ 590 cm-1 y ̴ 610 cm-1, respectivamente
(ver Figura 7.3). En este primer ejemplo, las señales de ambas especies coadsorbidas son claramente visibles y presentan, en alguna región del espectro, algún grado de solapamiento (como los picos centrados a 1645 cm-1 de NB y 1650 cm-1 de RH6G).
Comenzaremos el análisis basándonos en la región espectral en torno a ̴ 600 cm-1 (ver
recuadro en la Figura 7.5a). La aplicación de PCA a esta región permite identificar rápidamente la presencia de dos componentes principales que están siendo moduladas (autovectores de la Figura 7.5b). Como se explicó anteriormente, dado que PCA es una técnica de descomposición lineal, los resultados del análisis (autovectores) son por lo general una combinación lineal de la respuesta real del sistema. Este hecho puede apreciarse mejor en el autovector rojo de la Figura 7.5b, donde hay una pequeña contribución del mismo en la región donde el autovector azul tiene su máximo.
Para pasar de los autovectores “originales” a los “reales” (que representan la contribución individual de NB y RH6G al espectro) es necesario realizar una transformación lineal de los mismos (lo llamaremos rotación, ver Apéndice B para mayores detalles). Esta transformación ya ha sido utilizada en la aplicación de PCA a medidas de SERS.48 Los autovectores rotados (Figura
7.5c) representan las contribuciones individuales de NB y RH6G al espectro. Una vez conocidos los autovectores rotados (V1 y V2) se puede realizar una descomposición lineal sobre cada uno de
160 Capítulo 7 cada It cuál es la contribución de V1 y V2. De esta forma cada espectro de la serie temporal puede
ahora representarse como It = C1V1 + C2V2 donde C1 y C2 son los coeficientes que representan la
contribución de NB y RH6G a cada espectro individual. En la Figura 7.5d se muestra la variación de los coeficientes C1 (NB) y C2 (RH6G) a lo largo de t (para la ventana espectral analizada) y la
Figura 7.5e se amplía una de las regiones para una mejor visualización. De estas dos últimas Figuras se desprende como las dos especies están siendo moduladas de forma independiente de acuerdo a sus propias propiedades redox. Las moléculas de NB presentan un perfil de variación de la señal SERS como la mostrada en la Figura 7.4 para el caso de NB “puro”, mientras que las pequeñas variaciones de la intensidad SERS de RH6G pueden atribuirse al comienzo de la
reducción de las mismas a E ≈ -0.45 V, las cuales son prácticamente imperceptibles cuando se
analiza el espectro modulado de RH6G “puro”. La escala temporal utilizada puede ser fácilmente transformada a potenciales aplicados (a t = 0 tenemos E = -0.55 V y la velocidad de barrido es de 0.05 V.s-1). Los coeficientes de las Figuras 7.5d y e se encuentran en unidades arbitrarias (u.a.) ya
que la intensidad Raman (que les dio origen) está también medida en u.a. Sin embargo la importancia reside en sus valores relativos, ya que representan las contribuciones individuales de cada especie para cada t al espectro total. Otro hecho que también se observa a partir de la evolución de los coeficientes en el tiempo es las disminución progresiva de los mismos; esto podría estar relacionado a la destrucción de las moléculas debido a la energía del láser incidente (photobleaching). Este en un problema general en SERS y es la causa principal por la cual no es posible obtener un número ilimitado de espectros. Como veremos más adelante este puede ser un inconveniente importante al momento de analizar otro tipo de muestras.
A partir de la Figura 7.5 podemos concluir que: la combinación de modulación electroquímica y PCA permite independizar y separar las señales de las dos especies y de esta forma resolver este caso sencillo de congestión espectral. Por otro lado es posible también a partir de la variación de los coeficientes identificar los rangos de potencial donde las distintas especies
están siendo moduladas. Esto puede ser evidenciado en el “desfasaje” de los coeficientes producto
Capítulo 7 161
Figura 7.5. a)Espectro SERS promedio de la mezcla NB (20 nM) y RH6G (40 nM) modulada electroquímicamente entre -0.05 y -0.55 V (vs Ag/AgCl) a v = 0.05 V.s-1 en buffer fosfato pH = 6.
Se remarca la región espectral en torno a 600 cm-1 que contiene los picos a 590 cm-1 de NB y 610
cm-1 de RH6G. b) Autovectores (azul de NB y rojo de RH6G) obtenidos en el análisis de PCA de
la región espectral de 600 cm-1. c) Autovectores rotados V
1 (NB) y V2 (RH6G) que representan la
contribución individual de cada una de las especies al espectro total. d y e) Coeficientes que describen mediante una combinación lineal de V1 y V2 la contribución de cada especie a cada uno
de los espectros de la serie temporal.
Pasamos ahora a un caso más complejo que implica el análisis de todo el espectro SERS de la mezcla (no solo una región como en el caso anterior). Al ampliar la región espectral surge un nuevo problema que podría interferir en el análisis de PCA y es la variación en la línea de base de los espectros (background). Dichas modificaciones pueden tener variados orígenes y son un problema habitual en SERS.49 En nuestro caso nos concentraremos solo en las señales Raman y
por lo tanto sustraeremos las líneas de base mediante el programa de libre acceso COBRA.50 En la
Figura 7.6 se presenta un análisis de iguales características al realizado anteriormente pero para todo el espectro SERS de la mezcla NB y RH6G (Figura 7.6a). Una vez rotados, los autovectores V1 y V2 logran recuperar el espectro completo de cada una de las moléculas presentes en la
162 Capítulo 7
Figura 7.6. a)Espectro SERS promedio de la mezcla NB (20 nM) y RH6G (40 nM) modulada electroquímicamente entre -0.05 y -0.55 V (vs Ag/AgCl) a v = 0.05 V.s-1 en buffer fosfato pH = 6.
Se remarca la región espectral que será analizada con PCA. b) Autovectores (azul de NB y rojo de RH6G) obtenidos en el análisis de PCA. c) Autovectores rotados V1 (NB) y V2 (RH6G) que
muestran el espectro SERS completo de cada una de las sustancias presentes en la muestra. d) Coeficientes que describen mediante una combinación lineal de V1 y V2 la contribución de cada
especie a cada uno de los espectros (de la mezcla) en la serie temporal.
Para verificar la efectividad del método de modulación electroquímica en la separación de los espectros SERS completos de NB y RH6G, en la Figura 7.7 presentamos una ampliación (de la Figura 7.6c) de la región espectral en torno a 1650 cm-1. Como ya anticipamos, en dicha región
ambas moléculas presentan un pico relacionado a la vibración de los anillos aromáticos a frecuencias muy similares: 1645 cm-1 para NB y 1650 cm-1 para RH6G. En el espectro de la
mezcla la superposición de estos picos es total. Sin embargo, luego de la modulación electroquímica y el análisis de PCA es posible deconvolucionar ambas contribuciones.
Figura 7.7. Deconvolución de la región espectral en torno a 1650 cm-1. Es posible separar la
contribución de cada una de las especies incluso en regiones de superposición total de picos. Hasta aquí presentamos los resultados para un caso sencillo de congestión espectral donde ambos componentes tienen una contribución comparable a la intensidad del espectro SERS de la
Capítulo 7 163 mezcla y pueden ser además fácilmente separados a partir de sus fluctuaciones en los ciclos de modulación electroquímica. En la próxima sección abordamos un caso más complejo que implica recobrar las señales de una especie en presencia de otra que domina completamente el espectro SERS.