VI. MATERIALES Y MÉTODOS
VII.4. Morfología celular de las esporas germinadas de Moniliophthora rorer
cultivado bajo FES
La morfología del hongo M. roreri MRO1 fue registrada cada 24 h durante todo el
proceso del sistema de FES. Después de 24 h de incubación (día 1), se encontraron esporas germinadas, de formación basal, hialinas, en su mayoría de forma ovoide o elipsoidales (E) y pocas de tipo globosa (G) (Fig. 11A). Las células conservaron su forma hasta alrededor de los 12 días de incubación, cuando se observaron esporas formando cadenas e hifas hialinas en estado joven (Fig. 11A-K), sin septos (Fig. 11L- Rr) y septados (Fig. 11S) o pluriseptados en etapa avanzada (Fig. 11T-X), con conidióforos ramificados (Fig. 11X-Z) más o menos verticales, que dan lugar a cadenas maduras de conidios (Fig. 11Z).
41
Figura 11. Estructuras conidiales formadas por M. roreri MRO1 cultivado en el sistema FES usando BCA como sustrato, durante 30 días de incubación. A-Z, indica los días 1 a 30 del sistema FES. Se observan: A-E) esporas germinadas, de formación basal, hialinas, en su mayoría de forma ovoide o elipsoidales (E) y pocas de tipo globosa (G). E-K) esporas formando cadenas (EC) e hifas hialinas en estado joven. L-M) hifas hialinas sin septos (HSS) y N) hifas hialinas septadas (HS). Ñ-X) hifas hialinas pluriseptadas (HPS) en etapa avanzada. Y-Z) conidióforos ramificados (CR) más o menos verticales. Z) conidióforos ramificados con cadenas de esporas o conidios maduros (CEM).
HS
42
VIII. DISCUSIÓN
Moniliophthora roreri es el agente causal de la moniliasis del cacao, una enfermedad
destructiva presente en nueve países del sur y Centroamérica y en México (Phillips- Mora, 2004). Sin embargo, se conoce muy poco sobre la fitopatogenicidad del hongo y su planta hospedera, así como las actividades enzimáticas involucradas en la patogénesis. Así mismo, las enzimas proteolíticas en hongos fitopatógenos ha sido poco estudiado, existiendo solo algunos reportes en la literatura (Mercadoet al., 2003a;
Pousserau et al., 2001a).
En la presente investigación se observó que a medida que transcurre la fermentación, el valor de pH encontrado incrementó de un valor inicial de 6.03 a un valor final 6.54. Este comportamiento de pH, es semejante a lo encontrado en el ICA (s.f.) en Colombia (1979), quienes reportaron que M. roreri es capaz de crecer en medios con intervalos
de pH de 3.5 a 8.0, siendo el óptimo de 5.0 a 6.5 para que el desarrollo micelial sea abundante, pero es capaz de crecer a pH de 7.0 y a medida que el hongo se desarrolla el pH del medio tiende a alcalinizarse.
La literatura describe la producción de proteasas extracelulares a partir de diversos hongos. Venera et al. (1997), reportan la caracterización y determinación de los
parámetros cinéticos de una proteasa coagulante de la leche, a partir de Mucor bacilliformis. El pH óptimo de actividad de esta proteasa resultó ser de 3.0 y 3.5 para
homoglobina y caseína usados como sustrato proteolítico, respectivamente.
Siala et al. (2009) reportaron la producción, purificación y caracterización de una
proteasa ácida extracelular a partir del hongo Aspergillus niger l1. Esta enzima fue
óptimamente activa a pH 3.0 y la actividad enzimática disminuyó significativamente a valores de pH menores. Se han reportado valores óptimos de pH entre 3.0 y 5.5 para proteasas activas de otros hongos tales como Penicilium camembertii, pH 3.5
43
Kumar et al. (2005) también reportaron una actividad enzimática de 3,775.6 Umg-1
proteína total, a partir del extracto crudo, usando caseína como sustrato proteolítico, mientras que los resultados obtenidos en la presente investigación indican una actividad enzimática máxima de mrAe de 24.66 Umg-1 en el día 24 de la FES.
Mercado et al. (2003a), reportaron la actividad de dos proteinasas pumA y pumB en el
hongo fitopatógeno y dimórfico Ustilago maydis. La proteinasa pumA fue determinada a
nivel intracelular (pumAi) y extracelular (pumAe) con hemoglobina ácida desnaturalizada como sustrato. La actividad pumAe (78.53 mU/mg de proteína total), sólo fue detectada en células cultivadas en el medio mínimo YNB con sulfato de amonio como fuente de nitrógeno. La actividad específica empezó a incrementar después de 12 h de cultivo, y los valores máximos alcanzados después de 24 h permanecieron constantes durante la fase estacionaria. Bajo las condiciones antes mencionadas, el medio de cultivo se acidificó en función del tiempo de incubación, en contraste con el medio completo, en el cual el pH permaneció cerca de la neutralidad, dando lugar a la transición dimórfica levadura-micelio (Mercado et al., 2003a). Estos
resultados se contraponen a los obtenidos en el presente trabajo, en el cual el pH permaneció cercano a la neutralidad, dando lugar a la formación de micelio, mientras que los máximos niveles de actividad de mrAe alcanzaron un valor máximo de 24,690 mU/mg de Proteína total.
Los autores también reportaron ensayos de inhibición con pepstatina, inhibidor específico de aspartil proteasas. La proteinasa pumAi en su totalidad, mientras que pumAe fue inhibida en casi un 40%, en las dos cepas FB1 y FB2 de U. maydis
(Mercado et al., 2003a). Posteriormente, la pumAe fue purificada y caracterizada por
los mismos autores, reportando que dicha endoproteasa es insensible a la pepstatina A, por lo que describen que el sitio activo de esta proteinasa ácida no aspartil pudiera ser diferente al de la familia de aspartil proteasas (Mercado et al., 2003b).
En general, la determinación de actividad de proteinasas a partir de extractos crudos fresco, en diferentes hongos es difícil, debido a la presencia de inhibidores endógenos
44
que se unen fuertemente a sus proteinasas durante la desintegración celular (Schuet al., 1991). Es importante señalar que la metodología empleada fue muy acertada en la
determinación de la actividad enzimática de mrAe; sin embargo, no se descarta la posibilidad de la presencia de inhibidores endógenos para esta endoproteasa.
Radha et al. (2011), estudiaron la producción y optimización de proteasas ácidas por Aspergillus spp cultivado bajo fermentación sumergida. La actividad de proteasa fue
gradualmente incrementada de pH 3.0 a pH 5.0 y fue disminuida a pH neutro y alcalino. El pH del cultivo de fermentación después de 120 h de incubación disminuyó hasta 2.25. La proteasa ácida fúngica mostró un intervalo de pH óptimo de 4.0 a 4.5 y estable a valores de pH desde 2.5 a 6.0 (Cristóbal et al., 2008). La producción máxima de
enzima y masa seca fúngica fue observada a pH 5.0. De manera similar, Ganesh et al.
(2008), reportaron que el pH óptimo fue en el intervalo de 5.5 a 6.5 para la producción de proteasa ácida a partir de especies debacterias anaerobias Gram negativas del grupo Synergistes, cultivados con desechos sólidos de curtidurías.
Durante el transcurso de una fermentación, es imperativo seguir el patrón de crecimiento del organismo sobre su sustrato fermentativo y correlacionar dicho patrón de crecimiento del hongo con la producción del metabolito deseado por el microorganismo. Por lo anterior, la fermentación debe llevarse a cabo sólo hasta el momento en que ocurre la máxima producción de metabolitos (Sumantha et al., 2008).
Al respecto, se observó que la máxima producción de la enzima mrAe se encontró cuando M. roreri MRO1 presentaba su morfología en forma de hifas hialinas
pluriseptadas en etapa avanzada.
Con estos resultados, se acepta la hipótesis planteada. Es decir, el hongo M. roreri
MRO1 es capaz de producir actividad enzimática de endoproteasas ácidas extracelulares (mrAe) usando bagazo de caña de azúcar como sustrato mediante FES. Hasta el momento, no se han reportado estudios a cerca del comportamiento de M. roreri cultivado bajo FES empleando sustratos inductores de endoproteasas ácidas
45
extracelulares. Este trabajo constituye el primer reporte de la expresión de este tipo de enzimas en el hongo M. roreri, una importante línea de investigación sobre este tipo de
enzimas.
La morfología de M. roreri concuerda con lo reportado por Thorold (1975), Kranz (1978)
y Evans et al. (1978), Arguello 1990, López et al. (2006) y Suárez (2006), los cuales
encontraron conidias globosas, hifas y conidias hialinas durante su estado joven; micelio hialino y brillante. Evans (1981) y Suárez (2004) reportan que las esporas son globosas, subglobosas yelípticas.
Con respecto a la biomasa el incremento de biomasa celular fue mínima durante los 30 días del sistema FES.
46
IX. CONCLUSIONES
1. El hongo Moniliophthora roreri MRO1 produce endoproteasa ácida extracelular
(mrAe), con una de actividada enzimática de 24.69 Umg-1proteína total, pH de 6.09 y una biomasa de 0.255 g correspondiente al día 24 de incubación, cuando es cultivado en el sistema FES usando bagazo de caña de azúcar como sustrato inductor.
2. El valor de pH del medio de cultivo del sistema FES permaneció cercano a la neutralidad.
3. La morfología de Moniliophthora roreri, presentó esporas germinadas, de formación
basal, hialinas, en su mayoría de forma ovoide o elipsoidales y globosas. Esporas formando cadenas e hifas hialinas en estado joven, sin septos, septados y pluriseptados y conidióforos ramificados.
47
X. PERSPECTIVAS
1. Ensayar la producción de enzimas mrAe por el hongo M. roreri MRO1, cultivado en
el sistema FES con BCA como sustrato y diferentes valores de pH.
2. Determinar la actividad de mrAe de M. roreri cultivado en el sistema FES ensayando
otros desechos agrícolas como sustrato inductor.
3. Purificar y caracterizar enzimas con actividad de endoproteasa ácida extracelular (mrAe).
48
XI. BIBLIOGRAFÍA
Abdehl, A. T. H., Kennedy, E. H. y Ahearn, D. G. 1977. Journal of Bacteriology. 130: 1125-1129.
Acosta, L., Bustos, G. y Portugal, D. 1988. Aislamiento y caracterización de cepas de
Pleurotus ostreatus y su cultivo en residuos agroindustriales en el Estado de
Morelos, en Revista Mexicana Micología. 4: 13-20.
Akcan, N. y Uyar, F. 2011. Production of extracellular alkaline protease from Bacillus subtilis RSKK96 with solid state fermentation. 5: 64-72.
Alves, M. H., Campos, G., Okada, K., Ferreira, I. y Milanez, A. 2005. Detection of a extracelular protease in Mucor sp. Iberoamericana de micología. 22:114-117.
Ampuero, C. E. 1967. Monilia pod rot of cocoa. Cocoa Growers. Bulletin 9:15-18.
APROCACAHO (Asociación de productores de cacao en Honduras). 2003. Identificación y control de la moniliasis del cacao. Fundación Hondureña de investigación agrícola. 2-11 p.
Aranzazu, F. 2000. Escoba de bruja en Colombia, su Impacto Económico y Manejo. In: Mejía F.L.A. y Arguello, C.O. (Compiladores). Tecnología para el Mejoramiento del Sistema de Producción del Cacao. Bucaramanga, Colombia: CORPOICA. 144 p.
Arguello, O. 1990. Seminario Nacional de Actualización en Cacao con énfasis en la rehabilitación de plantaciones. Ministerio de Agricultura, Instituto Colombiano agropecuario. Subgerencias de Transferencia de Tecnología y de Investigación, ICA. Manizales. 27-29 p.
Baker, R. E., Cope, F. W., Holliday, P. C., Bartley, B. G. y Taylor, D. J. 1954. The anglocolombian cacao collecting expedition. A report on cacao research. St. Augustine, Trinidad: Imperial Collage. 8-29 p.
Barros, N. O. 1975. Influencia del pH en el crecimiento del hongo Monilia roreri Cif. y
49
Barros, N. O. 1980. Historia de la moniliasis y sus repercusiones en los países productores de caco en Sudamérica. In. Enríquez, G. A. (edit.) 1982. La moniliasis del cacao. CATIE, Turrialba, Costa Rica. Serie técnica: Informe Técnico. 28: 14-17.
Basten, D. E., Visser, J. y Schaap, P. J. 2001. Lysine aminopeptidase of Aspergillus niger. Microbiology. 147: 2045-50.
Bermúdez, R. C., Traba, J., Verdecia, M. y Gross, P. 1994. Producción de Pleurotus sp.
cfr. Florida sobre residuales de la agroindustria cafetalera en Cuba, en Micología Neotropical Aplicada. 7: 47-50.
Bermúdez, R. C., García, N., Gross, P., Serrano, M. 2001. Cultivation of Pleurotus on
agricultural substrates in Cuba. Micología Aplicada International. 8 (1): 25-29. Bhat, M. K. 2000. Celulases and related enzymes in biotechnology. Biotechnol. 18: 355-
383.
Bosmann, H. B. 1973. Protein catabolism. 11. Identification of natural and acidic proteolytic enzymes in Aspergillus niger. Biochem. Biophy. Acta. 293:476-89.
Boye, K., Stummann, B. M. y Henningsen, K. W. 1992. cDNA cloning and sequencing of the bean yellow mosaic virus nuclear inclusion protein genes. Plant Mol. Biol. 18:1203-1205.
Bowers, J. H., Bailey, B. A., Hebbar, P. K., Sanogo, S. y Lumsden, R. D. 2001. The impact of plant diseases on world chocolate production. Online. Plant Health Prog. doi:10.1094/PHP-0709-01-RV.
Cabello, A. 1986. Caña de azúcar y alimentación animal. La industria de los derivados de la caña de azúcar. ICIDCA. Ed. Científico-Técnica.La Habana, Cuba. 383- 395 p.
Calvo, L. y Sánchez, J. 1993. Producción de hongos comestibles en condiciones rústicas bajo un cacaotal y utilizando cáscara de coco como sustrato, Proceed. 11 th. Int. Cocoa Res. Conf. Cocoa Producers Alliance, Yamoussoukro, Ivory Coast. 18-24
50
Capriles, R.L., s.f. 1977. Enfermedades del cacao en Venezuela. Fondo Nacional de Investigación Agropecuaria, Venezuela. 79 p.
Carrillo, J., Salazar, M., Hernández, R., Huerta, S. y Prados, A. 2008. Caracterización de la cinética de producción proteasas fúngicas por fermentación en estado sólido a partir de una cepa aislada de queso Philadelphia. Páginas sin números.
Chekireb, D., Tahar, A. y Cochet, N. 2009. Acid protease production by isolated species of Penicillium. European journal of scientific research. 25(3):469-477.
Chellappan, S., Jasmin, C., Basheer, S.M., Elyas, K.K., Bhat, S.G., Chandrasekaran, M. 2006. Production, purification and partial characterization of a novel protease from marine Engyodontium album BTMFS10 under solid state fermentation.
Process Biochemistry. 41:956-961.
Chou, C. C. y Rwan, J. H. 1995. Mycelial propagation and enzyme production in koji prepared with Aspergillus oryzae on various rice extrudates and steamed rice.
J. Ferment. Bioengg. 79:509-512.
Chrzanowska, J., Klaczkowska, M., Dryjanski, M., Stachowiak, D., Polanowski, A. 1995. Aspartic proteinase from Penicillium camemberti: purification, properties and
substrate specificity. Enzyme. Microb. Technol. 17:719-724.
Couri, S., Terzi, S. C., Pinto, G. A., Freitas, S. P. y Costa, A. C. 2000. Hydrolytic enzyme production in solid-state fermentation by Aspergillus niger 3T5B8.
Process Biochem. 36:255-261.
Cristobal, N. A., Gerardo, G. S., PLilia, A. B., Herrera, R. R., José, L., Hernandez, M. y Juan, C. 2008. American Journal of Biochemistry and Biotechnology. 4(4):354- 366.
Davies, D. R. 1990. The structure and function of the aspartic proteinases. Ann Rev Biophys Biophys Chem. 19:189-215.
Dal Degan, F., Ribadeau, B. y Breddam, K. 1992. Purification and characterization of two serine carboxypeptidases from Aspergillus niger and their use in C-
51
terminal sequencing of proteins and peptide synthesis. Appl. Environ. Microbiol. 58:2144-52.
De-Paula, E. H., Ramos, L. P. y Azevedo, M. O. 1999. The potential of Humicola grisea
var thermoida for bioconversion of sugar cane bagasse. Bioresource Technology. 68:35-41.
Desrosiers, R. y Díaz, J. 1957. The World Distribution of Diseases of Cacao. In. Proceedings of the Sixth Meeting of the Inter-american Technical Committee of Cacao, Salvador, Brazil. 331-344 p.
Desrosiers, R. y Suarez, C. 1974. Monilia Pod Rot of cacao. In: Gregory P.H. (ed.)
Phythophthora Diseases of Cocoa. Logman Group, London. 273-277 p.
Eliécer, C. J. 2003. Producción y aplicación de enzimas industriales. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Departamento de Ingeniería Agroindustrial, Universidad del Cauca, Popayán Grupo de investigación Asubagroin.10-15p. Enríquez, G. y Suárez, C. 1978. Monilia disease of cocoa in Costa Rica. Turrialba
28:339-340.
Enríquez, G. A. 1981. La moniliasis irrumpe en las zonas cacaoteras en Costa Rica. Actividades en Turrialba. 9:8-9.
Enríquez, G. A. Brenes, O. y Delgado J. C. 1982. Desarrollo e impacto de la moniliasis del cacao en Costa Rica. Proceedings of the Eighth International Cocoa
research Conference. Cocoa Producer’s Alliance, Cartagena, Colombia. 375-
380 p.
Evans, H. C., Stalpers, J. A., Samson, R. A. y Benny, G. L. 1978. On the taxonomy of
Monilia roreri, an important pathogen of Theobroma cacao in South America.
Can. J. Bot. 56:2528-2532.
Evans, H. C. 1981. Pod rot of cacao caused by Moniliophthora roreri (Monilia) London,
UK: Commonweaalth Micological Institute. Phytopatological. 24:44p.
Evans, H. C. 2002. Invasive neotripical pathogens of tree crops. micromycetes. In: Watling R, Frankland J, Ainsworth M, Isaac S, Robinson C (eds) Tropical mycology. CABI Publishing, Wallingford. 2:83-112 p.
52
Evans, H. C., Holmes, K. A. Phillips, W. y Wikilson, M. J. 2002. What’s in a name:
Crinipellis, the final resting place for the frosty pod rot pathogen of cocoa?.
Mycologist. 16:1-4.
Fang, Y., Liu, S., Wang, S. y Ly M. 2008. Isolation and screening of a novel extracellular organic solvent-stable protease producer. Biochem Eng J. 43:212-215.
Fernandez, H. M., Fraile, E. R. y Cascone, O. 1998. Acid protease recovery from a solid-state fermentation system. J. Biotechnol. 62:83-93.
Figueroa, V. y Ly, J.1990. Alimentación porcina no convencional, Colección GEPLACEA, Serie Diversificación, México. 215 p.
Fox, D. J., Gray, P. P., Dunn, N. W. y Marsden, W. L. 1987. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 40:117-132.
Fulton, R. H. 1989. The cacao disease trilogy. Black pod, Monilia pod rot and Witches’ broom. Plant Disease. 73:601-603.
Galindo, J. J. y Enríquez, G. A. 1983. Investigaciones realizadas sobre la moniliasis del cacao en Centro y Sur América. In: Reunión anual de la Sociedad Americana de fitopatología, división Caribe, Panamá. 28 p.
García, N. 1999. Producción de setas comestibles Pleurotus ostreatus sobre
subproductos del café y del cacao, Tesis de Máster en Biotecnología, Centro de Estudios de Biotecnología Industrial, Universidad de Oriente. 90 p.
Ganesh, K. A., Nagesh, N., Prabhakar, T. G., Sekharan, G. 2008. Bioresource Technol. 99(7):2364-72.
Griffith, W. G., Nicholson, J., Nenninger, A., Birch N. R. y Hedger, J. 2003. Witches’ brooms and frosty pods: two major pathogens of cacao. New Zealand Journal of Botany. 41:423-435.
Guadix, A., Guadix, E., Páez, M., González, P. y Camacho, F. 2000. Procesos tecnológicos y métodos de control en la hidrólisis de proteinas. Arspharmaceútica. 41(1):79-89.
Guangrong, H., Dehui, D., Weilian, H. y Jiaxin, J. 2008. Optimization of medium composition for thermostable protease production by Bacillus sp. HS08 with a
53
Gupta, R., Beg, Q. K. y Lorenz, P. 2002. Bacterial alkaline proteases: molecular approaches and industrial applications. Appl. Microbiol Biotechnol. 59:15-32. Guzmán, G. 1993. El cultivo de los hongos comestibles, México, Instituto Politécnico
Nacional, México.120 p.
Hajj, M., Kanoun, S., Nafri, M. y Gharsailah, N. 2007. Purification and characterization of a alkaline serine produced by a new isolable Aspergillus clavatus ESI
process. Biochem. 42:491-797.
Hartley, B. S. 1960. Proteolytic enzymes. Annu. Rev. Biochem. 29:45-72.
Hernández, T., Aránzazu, F., Arévalo, E. y Ríos, R. 1990. La moniliasis del cacao en el Perú. Agrotrópica. 2:56-58.
Hirsch, H. R., Suárez, P., Achstetter, T. y Wolf, D. H. 1989. Yeast (Saccharomyces cerevisiae) proteinases: Structure, characteristics and functions. En molecular
and Cell Biology of Yeasts. Walton, E. F. y Yarranton G. T. Blackie and Son Ltd. London. 134-200 p.
Hoffman, T. 1974. Food related enzymes. Adv. Chem. Ser. 136:146-185.
Holtzapple, M., Cognata, M., Shu, Y. y Hendricson, C. 1990. Inhibition of T. reesei cellulase by sugars and solvents. Biotechnol Bioeng. 36: 275-287.
Holtzapple, M., Jun, J. H., Ashok, G., Patibandla, S. L. y Dale, B. E. 1991. Applied Biochemistry and Biotechnology. 29:59-74.
Holzer, H. y Heinrich, P. C. 1988. Control of proteolysis. Annu. Rev. Biochem. 49:63-91. Hossain, T., Das, F., Marzan. L. W., Rahman, S. y Anwer, M. N. 2006. Some properties
of protease of the fungal strain. Aspergillus flavus. I.J. Agri and Biology. 8:162-
164.
ICA (s.f.), Cif. y Par., Barros, O. 1980. Influencia del pH en el crecimiento del hongo
Monilia roreri. Medellín, Colombia.
Ichishima, E. 2004. Aspergillopepsin I. In Handbook of Proteolytic Enzymes, 2a. ed. (Barrett, A. J., Rawlings, N. D. y Woessner, J. F. eds). Elsevier, London. 92-99 p.
Inoue, H., Lu, J. F., Athauda, S. B., Kong, K. H., Hayashi, T., Kimura, T., Makabe, O. y Takahashi, K. 1995. Aspergillus niger var. macrospores proteinase B. cDNA
54
cloning, expression and activation of the proenzyme. Adv. Exp. Med. Biol. 362:581-587.
Inoue, H., Hayashi, T., Huang, X. P., Lu, J., Athanda, S. B., Kong, K., Yamagata, H., Ukada, S. y Takahashi, K. 1996. Heterologous expression and site directed mutagenesis studies on the activation mechanism and theroles of the basic residues in the prosegment of aspergillopepsinogenI. Eur. J. Biochem. 237:719-25.
Ishibashi, N., Ono, I., Kato, K., Shigenaga, T., Shinoda, I., Okai, H. y Fukui, S. 1988. Role of the hydrophobic amino acid residue in the bitterness of peptides. Agr. Biol. Chem. 52:91-94.
Kaar, W. E., Gutierrez, C. V. y Kinoshita C. M. 1998. Biomass and Bioenergy, 14:277- 287.
Kalisz, M. H. 1988. Microbial proteinases. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 36:17-55. Kamada, M., Oda, K. y Murao, S. 1972. Agricultural and Biological Chemistry, 36:1095-
1101.
Katip, J. Y. 1994. Prospección y estudio de la moniliasis (Moniliophthora roreri Cif. y
Par.) Evans et al) del cacao en la cuenca del río Marañón. Tesis Ing. Agr.
Tingo María Perú: UNAS. 94 p.
Kaur, M., Dhillon, Chaudhary, K. y Singh. R. 1998. Production, purification and characterization of a thermos table alkaline protease from Bacillus polymyxa.
Indian. J. Microbial. 38:63-67.
Keane, P. J. 1992. Diseases and pests of cocoa: an overview. Cocoa pest and disease management in Southeast Asia and Australisia. FAO Plant Prot Prot Pap 112:1-12.
Kembhavi, A. A., Kulharni, A., Pant, A. A. 1993. Salt-tolerant and thermostable alkaline protease from Bacillus subtilis NCIM No.64. Appl. Biochem. Biotechnol. 38:83- 92.
Klibansky, M., Mansur, M., Gutiérrez, I. y González, L. 1993. Production of Pleurotus ostreatus mushrooms on sugar cane agrowastes”, en Acta Biotechnology.
55
Kranz, J., Schmutterer, H. y Coch. W. Edits. 1978. Diseases, pests and weeds in tropical crops. John Wiley y Sons, New York, USA. 219-220 p.
Krauss, U. y Soberanis, W. 2001. Rehabilitation of diseased cacao fields in Peru through shade regulation and timing of biocontrol measures. Agroforestry System 53:179-184.
Krishna, C. 2005. Solid-state fermentation system an over view, Critical Rev. Biotechnol. 25(2):1-30.
Kumar, C. G. y Takagi, H. 1999. Microbial alkaline proteases: from a bioindustrial viewpoint. Biotechnol Adv. 17:561-594.
Kumar, S., Sharma, N. S., Saharam, M. R. y Cind, R. 2005. Extracellular acid protease from Rhizopus oryzae. Purification and characterization process. Biochem.
40:1701-1705.
Liu, J. Z., Huang, Y. Y., Weng, L. P. y Ji, L. N. 2001. Effects of metal ions simultaneous production of glucose oxidase and catalase by Aspergillus Niger. Lett Appl
Microbiol. 32:16-19.
López, G. M. y Enríquez, V.O. 1980. Presencia de Monilia roreri Cif. Et al. Par. en el
cacao, Theobroma cacao L., en la frontera de Costa Rica-Nicaragua.
Ministerio de Desarrollo Agropecuario.150 p.
López, B. O., González, M. O., Lee, R. V., Alvarado, G. A., Ramírez, G. S., González, R. M., Méndez, R. J. y Gehrke, V. M. 2006. Diagnóstico y Técnicas para el Manejo de Tecnológica de Colombia. ISBN: 970ـ985ـ07ـ0, 40 p.
Lowry, O.H., Rosenbough H.I., Fair, A. Z. y Rondall, R.I. 1951. Protein measurement with the phenol reagent, J. Biol. Chem. 193:165-275.
Maddison, A.C., Macias, G., Moreira, C., Arias, R., y Neira, R. 1995. Cocoa production in Ecuador in relation to dry-season escape from pod rot caused by Crinipellis perniciosa and Moniliophthora roreri. Plant pathology 44:982-998.
Maddox, I. S. y Hough, J. S. 1970. The Biochemical Journal, 117: 843-852.
Mala, B.R., Aparn, M. T., Mohini, S. G. y Vasanti, V. D. 1998. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases. Microbiology and Molecular Biology Reviews 62(3):597-635.
56
Maldonado, M. C. y Strasser de Saad, A. M. 1998. Production of pectinesterase and polygalacturonase by Aspergillus niger in submerged and solid state
systems.Journal of Industrial Microbiology y Biotecnology. 20:34-38.
Martín, P. C. 1981. Utilización de subproductos fibrosos de la caña de azúcar por los rumiantes. Efecto de la suplementación en el comportamiento de novillas lecheras alimentadas con bagacillo predigerido. Rev. cubana Cienc. Agríc. 15(7):9-13.
Martin, C., Galbe, M., Wahlbom, C. F., Hahn, B. y Jonsson, L. 2002. Enzyme and Microbial Technology. 31:274-282.
Martínez, D. 1987. Design of a mushroom farm for growing Pleurotus on coffee pulp, en
Mushroom Journal Tropics. 7:13-23.
McLaughlin, H. 1950. Observation on cacao in Perú. Cacao Information Bulletin 2:3-4. Mercado, Y., Hernandez, C. H., Ruíz, H. J., Villa, L. 2003a. Proteinases and
exopeptidases from the phytopathogenic fungus Ustilago maydis. Mycologia.
95:327-339.
Mercado, Y., Guerra, G., Villa, L., Hernández, C. 2003b. Purification and Characterization of an Extracellular Non-Aspartyl Acid Protease (pumAe) from
Ustilago maydis. Microbiol. 47:408-411.
Mercado, Y., Noriega, Y., Ramírez, B., Hernández, C., Villa, L. 2004. Purification y characterization of Aminopeptidase (PUMAPE) from Ustilago maydis. FEMS.
Microbiol. Lett. 235:369-375.
Milewski, S. F., Mignini, I., Covelli, y Borowski, E. 1994. Specific inhibition of acid proteinase secretion in candida albicans by Lys-Nav-FMDP. J. Med. Mycol.