Morfología del péptido 33 mer en agua a pH 7.0

Teniendo en cuenta los resultados anteriores, se propone que el péptido es capaz de ensamblarse

formando oligómeros. Para visualizar las características de estos se utilizó técnicas de microscopia

electrónica TEM y SEM. A la concentraciones 613 µM, donde el equilibrio conformacional estaba desplazado hacia las estructuras β.181

Las muestras fueron preparadas depositando una alícuota del 33-

mer sobre un grid recubierto con Formvar y secado por capilaridad usando un papel de filtro para

TEM. Para SEM las muestras fueron depositadas sobre vidrio y se procedió a realizar un secado por

evaporación a temperatura ambiente. En el caso de TEM la muestra fue metalizada con acetato de

uranilo y en SEM con oro.

Al observar al 33-mer mediante TEM se detectó la existencia de distintas arquitecturas tales como

nano-esferas, fibrillas y fibras que se asociaban. Estas morfologías se encontraban distribuidas en los

distintos campos inspeccionados.

181

M. S. Celej et al, 'Toxic prefibrillar alpha-synuclein amyloid oligomers adopt a distinctive antiparallel beta-sheet structure' (2012) 443(3) Biochem J 719.

Capítulo IV: Resultados y Discusión 87

Figura 33. Imágenes de TEM del péptido 33-mer en solución acuosa, concentración 613 µM. A) Se presenta un

campo con fibrillas, fibras y auto-asociación de distintas fibras, junto con su evaluación estadística. B) Se presenta un campo constituido por nanoesferas del péptido y una fibrilla aislada, junto con la distribución de los diámetros de las nano-esferas.

En los distintos campos, se pudo observar la existencia de distintas morfologías, algunas de ellas

presentaban nanoesferas junto a fibrillas aisladas. Las nanoesferas poseían un diámetro medio de 25

nm ± 10 nm. Las fibrillas aisladas poseen un diámetro de 28 ± 5 nm (Figura 33 B).

En otras regiones, se observó que la predominancia de fibrillas y fibras (Figura 33 A). En estas

secciones, se observó que las fibrillas eran las estructuras preponderantes con un diámetros medio de

58 nm ± 6 nm. Estas tenderían a asociarse, produciendo un entramado de fibras ramificadas que

cubrieron un alto porcentaje del área estudiada. Es posible distinguir la existencia de dos poblaciones

Capítulo IV: Resultados y Discusión 88

mayor orden se generarían a partir de asociaciones laterales de fibrillas. Tanto las fibrillas como las

fibras poseían longitudes variables que se encuentran entre 220 - 800nm.

Figura 34: Imágenes TEM del péptido 33-mer en agua, presentándose las distintas estructuras observadas desde

un grado de mayor a menor complejidad. A) Se observa la presencia de fibrillas interactuando de manera lateral (marcado con flechas) unas con otras para generar fibras de mayor tamaño. B) Se distinguen las fibrillas con respecto a las nanoesferas presentes en el fondo. C) Se observa un filamento y flechas indicando que el mismo podría estar compuesto por nano-esferas. D) Se presentan un grupo de nanoesferas interactuando unas con otras.

En la Figura 34, se resumen las distintas estructuras observadas del péptido 33-mer en solución

acuosa a 613 µM. En esta figura se han empleado mayores magnificaciones, permitiendo de esta

manera detectar, la composición interna de las distintas morfologías observadas en la Figura 33. Es así

que en la Figura 34 A se pudo observar las interacciones laterales entre fibrillas, que darían origen a

las fibras. Por otro lado, se podría inferir que las fibrillas se habrían generado por interacción lateral de

nanoesferas y coalescencia de las mismas, tal como se observa en la Figura 34 B y C. Además se pudo

Capítulo IV: Resultados y Discusión 89

Por SEM se corroboraron los resultados obtenidos mediante TEM y debido a las características de

esta microscopía, se pudo obtener imágenes con detalles topográficos de las estructuras presentes. Para

estas microscopías se seleccionaron las superficies de vidrio y mica. Ambas superficies presentan una

naturaleza hidrofílica y son ampliamente utilizadas en microscopía. 182183

El péptido 33-mer sobre una superficie de vidrio presenta una morfología similar a la observada a

través de TEM (Figura 35). Mediante SEM, se distinguió la presencia de fibras y fibrillas, las cuales

presentaban diámetros similares a los determinados en TEM. Al aumentar la magnificación (Figura 35

C), se detectó la presencia de nanoesferas distribuidas al azar y asociaciones de las mismas. Además

fue posible observar que las fibrillas estaban constituidas de asociación de las nano-esferas.

182 _{P. R. Desjardins and Michael B. Barkley, 'Mica disc supports for particulate specimens for scanning}

electron microscopy' (Pt Blackwell Publishing Ltd) (1973) 97(3) Journal of Microscopy 389.

Capítulo IV: Resultados y Discusión 90

Figura 35. Imagen de SEM del péptido 33-mer en solución acuosa. A) Se observa un campo cubierto del péptido donde se encuentran fibrillas y fibras. Las imágenes B) y C) corresponden a acercamientos a las fibrillas, donde se puede observar además la presencia de nanoesferas. D) Distribución de los diámetros de las fibras y fibrillas observadas en A).

También se estudió la interacción del péptido 33-mer con mica por TEM y SEM. En este caso, se

observó que este fragmento peptídico se auto-asociaba, generando estructuras fibrilares ramificadas,

con un orden espacial repetitivo. (Figura 36 A). Además fue posible observar la arquitectura interna de

las fibras (Figura 36 B), las cuales están formadas por la interacción de fibrillas, tal como se observó

Capítulo IV: Resultados y Discusión 91

Figura 36. Imágenes de SEM del péptido 33-mer en solución acuosa utilizando mica como superficie. En A) es

posible apreciar la auto-organización de este fragmento peptídico. En B). se puede observar la presencia de nanoesferas, fibrillas , fibras y la constitución interna de dichas fibras.

Por lo tanto, mediante esta combinación de ME, haciendo uso de distintas superficies de

hidrofilicidad similar, fue posible determinar que el péptido 33-mer es capaz de auto-organizarse a la

concentración 613 µM. En esta solución, en la que se observaron cambios estructurales interesantes

mediante CD, se observó la presencia de diversos motivos, tales como nano-esferas, fibrillas, y fibras.

Estas dos últimas estructuras se encontrarían posiblemente formas por asociación de las nano-esferas.

4.1.5.2. Morfología del péptido 33 mer en Buffer (1 mM citrato de sodio, 1 mM borato de