misma especie, mediante la secuenciación de DNA de fragmentos interno de 6 a 8 genes de mantenimiento. Así cada muestra se caracteriza por las secuencias únicas de alelos en cada uno de los genes utilizados, lo que constituye su perfil alélico o secuencia tipo (ST); a cada secuencia única del gen se le asigna un número particular con el que será comparado cualquier nuevo aislamiento (Fig. 1.4). Esta técnica se utiliza principalmente para la tipificación de especies bacterianas, pero se ha aplicado también en levaduras como C. albicans, C.
neoformans y S. cerevisiae (Da Matta et al., 2010; Danesi et al., 2014; Wu et al., 2015). Actualmente existen bases de datos para C. albicans y C. neoformans. Figura. 1.4 Representación de la técnica MLST Justificación del trabajo y objetivos
En los últimos años la investigación en nuestro laboratorio se ha centrado en diversos aspectos relacionados con el crecimiento y supervivencia de las levaduras en ambientes extremos (de Silóniz et al., 2002), el estudio de levaduras deteriorantes de alimentos y bebidas (Casas, 1999), en el diseño de métodos de detección (Quirós et al., 2005; Quirós et al., 2006; Quirós et al., 2008; Romero et al., 2005), en la descripción matemática de su comportamiento (Gil de Prado et al., 2014) y en la elaboración de modelos predictivos (Rivas et al., 2014). Dentro de los géneros que han centrado nuestra investigación, el género
Zygosaccharomyces, que como ya hemos comentado, es uno de los más
peligrosos desde el punto de vista del deterioro, ha sido objeto de estudio en nuestro grupo sobre todo desde la perspectiva de la resistencia a conservantes (Casas et al., 2004; Quintas et al., 2005) y del deterioro de alimentos con aw intermedia (IMFs) (Wrent et al., 2003). La prevalencia de
la especie Z. rouxii en las industrias con las que hemos colaborado y la ausencia de un método adecuado de tipificación de cepas nos impulsó a tratar de desarrollar un método para ello. Además, en función de algunos resultados obtenidos previamente en nuestro laboratorio (Quirós et al., 2006; Romero et al., 2005) nos planteamos la hipótesis de que el análisis del polimorfismo de los fragmentos de restricción de la región IGS podría ser un método útil.
Por otro lado, D. hansenii es una especie que también ha sido objeto de nuestro estudio en el pasado (Quirós, 2005). Con el diseño de un método molecular de diferenciación de especies del género
Debaryomyces (Quirós et al., 2006) pudimos comprobar que las cepas de D. hansenii var. hansenii presentaban patrones claramente diferentes de
los de D. hansenii var. fabryi y de otras cepas de D. hansenii. Con la reestructuración del género, llevada a cabo recientemente (Suzuki et al., 2011), basada en diversos estudios genéticos (Kurtzman y Suzuki, 2010; Quirós et al., 2006), las dos variedades de D. hansenii pasan a ser dos especies diferentes: D. hansenii y D. fabryi y las cepas de D. hansenii, que presentaban un patrón diferente con nuestro método, a la especie D.
subglobosus. Las tres especies son muy difícilmente distinguibles
fisiológicamente e imposible, como hemos podido demostrar en esta Tesis, con algunas de las técnicas moleculares que se utilizan rutinariamente en los laboratorios (RFLP 5,8S‐ITS rDNA). La identificación
exacta es muy importante, entre otros motivos, porque uno de los principales factores que determina la validez de un estudio es la correcta identificación, ha sido, por tanto, nuestro objetivo el proporcionar una herramienta para la detección de D. hansenii, que es una especie de gran interés industrial como se expuso previamente, y de fácil ejecución en la industria. Los resultados obtenidos en nuestro laboratorio, en un contexto diferente al de esta Tesis, sobre la secuencia de genes que codifican para proteínas implicadas en la descarboxilación de sorbatos, serendipicamente nos permitieron plantear la hipótesis de que uno de los genes estudiados podría ser una buena diana. Finalmente, a petición de un laboratorio de control de calidad, otro de nuestros objetivos ha sido abordar un problema de deterioro que resultó ser causado por M. guilliermondii, para la que realmente no existía hasta la realización de esta Tesis un buen método de tipificación de cepas. La hipótesis fue que podría ser adecuado algunos de los siguientes métodos: polimorfismo de los fragmentos de restricción de la región IGS, polimorfismo de los fragmentos de restricción del DNA mitocondrial y análisis de microsatélites.
Por lo tanto, el objetivo general de esta Tesis es, por un lado, el desarrollo de métodos que faciliten la detección de especies y que sean relativamente sencillos para su utilización en los laboratorios de las industrias y por otro, el desarrollo de métodos adecuados para la tipificación de cepas. Este abordaje, se ha llevado a cabo en las tres especies mencionadas anteriormente (Z. rouxii, D. hansenii y M.
guilliermondii) cuyo interés en la industria se ha explicado en este capítulo
Atendiendo a estos antecedentes y al objetivo general expuesto anteriormente, en esta Tesis nos propusimos los siguientes objetivos específicos:
1. Desarrollar un método de tipificación que por sí sólo permita la diferenciación de cepas del género Zygosaccharomyces, con especial énfasis para la especie Z. rouxii.
2. Dilucidar él posible origen híbrido de las cepas de Z. rouxii (CECT 11923 and CECT 10425) ya que los resultados obtenidos en el objetivo 1 nos animaron a plantear esta hipótesis.
3. Desarrollar un método molecular para la detección de cepas híbridas de Zygosaccharomyces.
4. Desarrollar un método rápido y económico para la detección específica de D. hansenii.
5. Desarrollar un método para la tipificación intraespecífica de la especie
M. guilliermondii.
6. Estudiar y analizar la aplicación de algunos de estos métodos en un caso de deterioro de yogures ecológicos causado por M. guilliermondii.