y los mutantes defectivos.

Para la realización de estos ensayos se utilizaron células derivadas de epitelio pulmonar humano A549 (ATCC CCL185) y las cepas de B. bronchiseptica cultivadas previamente en medio líquido.

Las células de línea se cultivaron en el medio Eagle modificado por Dulbecco (Laboratorios Gibco) suplementado con suero fetal bovino (SFB) 10% p/v, estreptomicina (100 jig mi"1) y ampicilina (100 jig mi"1) hasta obtener un 70-80% de confluencia. Se sembraron placas de cultivo Nunclon Delta (Nunc, Rosklide, Denmark) de 24 lugares (well) con aproximadamente 8. 104 células por well 18 horas antes de cada ensayo. Para los ensayos de adhesión las células fueron sembradas sobre soportes de vidrio previamente dispuestos en los wells.

Los distintos mutantes ensayados y la cepa parental de B. bronchiseptica se cultivaron durante 12 horas a 37° C en frascos erlenmeyers agitados (160 rpm) conteniendo medio SS. Se suspendieron en el medio Eagle modificado por Dulbecco suplementado con SFB 10% p/v sin antibióticos hasta obtener una suspensión equivalente a DO65 0nm =0,003.

Se agregaron a cada well 8. 106 bacterias (proporción bacteria:células de 100:1) y se centrifugaron a 300 X g durante 5 minutos. Se incubaron 2 horas a 37° C y C02 5% y las monocapas celulares fueron lavadas al menos cinco veces con PBS estéril. i) Determinación del número de bacterias adheridas. Las células A549 crecidas sobre los vidrios fueron fijadas con metanol. Las mismas se tiñeron con cristal violeta (0,07 % p/v en agua) para ser cuantificadas mediante la observación en microscopio con contraste de fase con aumento 1.000 X. El número de bacterias adheridas por célula se determinó examinando al menos 50 células epiteliales según la técnica descripta por van den Berg y colaboradores (1999) (438).

ii) Determinación de la supervivencia intracelular. Luego de la incubación de 2 horas de duración y de los lavados descriptos anteriormente, las células eucariotas distribuidas en monocapa fueron incubadas 3 horas a 37° C, C02 5% para permitir la invasión bacteriana a las células. El medio fue entonces reemplazado por 0,5 mi de medio suplementado con polimixina B 300 jig mi'1 y Gentamicina 300 p.g mi'1 y se incubaron durante 1 hora a 37° C, C02 5% con el fin de eliminar las bacterias que no invadieron y se encontraban fuera de las células eucariotas. Luego de la incubación, la solución de antibióticos fue eliminada por lavados repetidos y reemplazada por medio Eagle modificado por Dulbecco suplementado con SFB 10% p/v, estreptomicina (100 iug mi'1) y ampicilina (100 jug mi'1). Las células que presentaban bacterias intracelulares se recuperaron tratando las monocapas con tripsina. El número de bacterias presentes se determinó mediante la siembra en SSs de las diluciones adecuadas. Con el fin de evaluar el número de células eucariotas viables, las mismas se tiñeron con el colorante vital Azul de Tripan. De esta manera se pudo calcular el número de UFC / célula eucariota.

Todos los experimentos que se han detallado fueron realizados al menos tres veces por duplicado. Los promedios y desviaciones estándar fueron calculados a partir de los logio UFC. Las diferencias entre los promedios fueron evaluados por un test de Student de dos colas con un grado de significación de P<0,05.

13. Ensayos de infección de la cepa parental Bb 9.73 y los mutantes defectivos empleando el modelo de infección intranasal en ratones

13.1. Determinación de la dosis letal cincuenta (DL50). La determinación de este

parámetro se realizó inoculando 5 grupos de 8 ratones BALB/c cada uno con cada cepa de B. bronchiseptica a ensayar. Cada ratón de cada grupo fue inoculado con una suspensión bacteriana conteniendo aproximadamente 108, 107, 106, 105 y 104 UFC/50 pl. A los distintos días post - inoculación se determinó el número de decesos en cada grupo y con estos datos se determinó la DL50.

13.2. Cinética de colonización en pulmones murinos La cinética de colonización

de las diferentes cepas de B. bronchiseptica fue evaluada empleando el modelo de infección intranasal murino. Para ello se emplearon ratones BALB/c hembras de 3 a 4 semanas de edad libres de patógenos provistos por el bioterio de la Facultad de Veterinaria de la UNLP. Para realizar las inoculaciones, los animales se anestesiaron por inhalación de éter. Como inoculo para cada ratón se empleó 50 jllI de la

suspensión bacteriana a ensayar (5. 105 UFC en PBS estéril, dosis subletal) proveniente de un cultivo líquido en fase logarítmica (Medio SS, 12 horas, 160 rpm, 37°C). El número de UFC a inocular se aproximó a través de medidas de absorbancia a 650 nm (1 unidad de Abs65 0nm = 3.109 UFC mi"1).

Con el fin de determinar el número de bacterias que colonizaron los pulmones del animal, transcurridas 4 horas desde el momento de la inoculación y en distintos días, se sacrificaron por dislocación tres animales, a los cuales se les extrajo a través de técnicas quirúrgicas ambos pulmones. Éstos se homogenizaron en 1,5 mi de PBS estéril con un homogeneizador con punta redonda de teflon de 0,966 pulgadas de diámetro (Colé Parmer) y a partir del homogenado se realizaron diluciones adecuadas para realizar el recuento de colonias en placas conteniendo SSs con los antibióticos adecuados según la cepa ensayada. Para el recuento de UFC las placas sembradas se incubaron a 37° C durante 48-72 horas.

Los animales utilizados fueron mantenidos en jaulas acondicionadas con viruta de madera esterilizada, la cual fue cambiada periódicamente y fueron alimentados con alimento balanceado esterilizado (Extrudado balanceado de Agrupación Cooperativas Argentinas).

En todos los ensayos realizados los promedios y desviaciones estándar fueron calculados a partir de los logi0 UFC. Las diferencias entre los promedios fueron evaluadas por un test de Student de dos colas con un grado de significación de P<0,05.

13.3. Detección de bacterias en los pulmones murinos mediante PCR. En los

ensayos de cinética de colonización de pulmones murinos, se realizó la detección de bacterias en los mismos a distintos días post - inoculación. A partir del momento en que ya no era posible recuperar bacterias viables de los pulmones de los ratones, el análisis de la presencia de Bordetella en el hospedador se realizó mediante ensayos de PCR. Para ello, a los pulmones extraídos de los ratones en días donde no se aislaron colonias se los homogeneizó y se los trató a 65°C durante una hora con una solución de pronasa (0,4 mg/ml en buffer Tris -HCI 12 mM pH: 7,6). Luego de inactivar a la pronasa con calor durante 10 minutos se procedió a realizar sobre esta muestra una PCR, utilizando los primers específicos flaAf y flaAr , siguiendo el protocolo más arriba detallado (pág. 55).

14. Análisis estadístico.

Los resultados de los ensayos fueron analizados evaluando los promedios y las desviaciones estándar mediante tests de Student de dos colas con un grado de significación de P<0,05.

bronchiseptica

fuera

del