necesario para conseguir que

asocie el EC al EI, que el animal como mínimo reciba en los primeros trials algo del EI (no es necesario todo el intervalo de tiempo); de forma que el animal con mayor nivel de aprendizaje realizaría un máximo de 49 evitaciones (ver Tabla 6, para definición operativa de conductas).

A continuación en la Figura 9, se representa cada ensayo de la sesión.

Figura 9.-Esquema conductual de cada ensayo en una sesión de la tarea de Shuttle-box.

Las sesiones se compusieron de 50 ensayos cada una, con una duración total oscilante entre 60 y 75 minutos, variable en función de la respuesta de cada animal (número de evitaciones/escapes). A continuación se muestra el repertorio conductual que se registró (Tabla 6).

MATERIALES Y MÉTODOS

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Tabla 6.-Repertorio de conductas registrado en la tarea de "Shuttle-box" 1. Número de evitaciones (evitación: cruce al otro compartimento durante la

presentación del EC, antes del inicio del EI).

2. Número de escapas (escape: cruce al otro compartimento una vez se ha iniciado la presentación del EI).

3. Número de cruces de compartimento entre ensayos (durante el periodo inter- trial).

4. Número de cruces de compartimento durante el periodo de habituación. 5. Tiempo de petrificación o "freezing" en inter-trials (del 2º al 6º) (conducta de

petrificación: ausencia de cualquier movimiento corporal salvo el movimiento vegetativo de la presión cardíaca y la respiración).

6. Número de defecaciones.

7. Latencia en el cambio de compartimento.

8. Número de "Freezing - none real" (número de ensayos con ausencia de cruces de compartimento durante el EI, es decir número total de fallos de escapada).

La batería conductual descrita se seleccionó para el registro conductual de este experimento por los siguientes motivos

- Laberinto Circular Elevado: se aplicó esta prueba incondicionada para poder comparar con resultados previos y por las correlaciones que tiene con otras pruebas de ansiedad incondicionada como la Caja Blanca-Negra (CBN), y con pruebas de ansiedad condicionada como la prueba de “shuttle-box” (López-Aumatell y cols., 2009 a, b).

- Test de la “Caja nueva”: se administró esta prueba de ansiedad incondicionada, porque permite: (a) recoger muestras hormonales post-estrés sin alterar la respuesta de estrés, ya que tiene 20 mintuos de duración, (b) comparar con resultados previos de nuestro laboratorio (López-Aumatell y cols., 2008), y (c) registrar de forma automática la actividad horizontal y vertical que realiza la rata en ese tiempo.

- Prueba de Shuttle-box: esta prueba se seleccionó por varios motivos: (1) Robustez en el

registro de comportamientos relacionados con la ansiedad y miedo condicionados. (2) las ratas Romanas fueron seleccionadas por el estilo de afrontamiento que desarrollan en esta prueba, con lo que sirve como referencia en la interpretación de los resultados de las ratas

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N/Nih-HS (Fernández-Teruel y cols., 1991). Y (3) en este experimento, las ratas N/Nih-HS se seleccionaron en función del número de evitaciones que realizaron durante esta prueba.

2º Análisis hormonal

Se extrajeron en los tres grupos de ratas experimentales, muestras hormonales (basales y posteriores a una situación de novedad) de corticosterona, prolactina y ACTH. La obtención de muestras de sangre se obtuvo a partir de un corte en la cola de aproximadamente 2 mm. (200 µl), y posteriormente se guardaron las muestras en tubos de 2.0 ml. (Eppendorf, Hamburg, Germany). Una vez obtenido el sérum (diferenciado del plasma por centrifugación), se guardaron en el congelador de -80 ºC.

La extracción de sangre se realizó de 9:30 a 13:00 de la mañana, y una semana más tarde todos los animales se expusieron durante 20 minutos a una situación de novedad por medio del test de la “Caja nueva” (Tabla 4) e inmediatamente posterior se les realizó la extracción de sangre post-estrés (tiempo máximo entre el fin de la prueba y la extracción de sangre de dos minutos por rata, Tabla 4).

Se empleó la técnica ELISA (“enzyme linked inmuno sorbent assay”), como procedimiento de ensayo inmunoenzimático. El lector utilizado para los análisis por ELISA fue EMS Reader MF V.2.9-0 y los reactivos utilizados para cada hormona fueron los siguientes:

o Parámetro de la prolactina (ntotal = 184; basal, n = 107 y post-stress, n = 77), se empleó el “Prolactin Rat ELISA” (“Demeditec Diagnostics GmbH”; Alemania).

o Parámetro de la corticosterona (ntotal = 230; basal, n = 123 y post-stress, n = 107), se utilizó el reactivo “Corticosterone EIA” (“Immunodiagnostic Systems Ltd”, IDS Ltd; Boldon, Reino Unido).

MATERIALES Y MÉTODOS

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o Parámetro del ACTH (ntotal = 33; basal, n = 16 y post-stress, n = 17), se aplicó el kit ACTH por Immulite® (Siemens). El aparato utilizado para obtener los resultados fue el Immulite® 1000 (Siemens).

3º Análisis estadístico de los resultados conductuales y hormonales

A partir del programa estadístico SPSS 17.0, se realizó un análisis descriptivo de los resultados de las tres cepas en cada prueba conductual y de los resultados hormonales. También se aplicó un MANOVA sobre los datos hormonales, analizando el tipo de cepa como factor inter-sujetos, el tiempo (diferencias pre y post stress) como factor intra-sujetos y la interacción posible entre ellos.

Se analizaron los datos conductuales, a partir de la aplicación del one-way ANOVA junto con la prueba post hoc de Duncan (diferencia significativa definida a partir de p<0.05). Y se aplicaron pruebas t de Student, para la comparación de medias entre grupos independientes.

Posteriormente, se calculó la matriz de correlaciones (Pearson’ correlation coeffient) con rotación oblicua (oblimin directo), en el que se comparaba el repertorio de conductas registradas de cada test aplicado y las variables hormonales (basal y post-stress de corticosterona, prolactina y ACTH). Y finalmente, se realizó un análisis factorial exploratorio a partir de un total de 14 variables, para los datos de la cepa N/Nih-HS. A partir del test de sedimentación de Cattle (Cattell’s Scree Test), se realizó un segundo análisis factorial aplicando la reducción de dos factores.

MATERIALES Y MÉTODOS

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3.3 ESTUDIO 2 (Julio-Diciembre/2011)

Características de la muestra

Se emplearon un total de 114 ratas machos, de tres cepas diferentes mantenidas en nuestro laboratorio: dos cepas consanguíneas Roman High- (RHA-I, n= 12) y Low- Avoidance (RLA-I, n= 12), y una cepa genéticamente heterogénea “N/Nih-HS” (n= 90). Al inicio del experimento los animales tenían aproximadamente entre 3.5 meses de edad y entre 291,24 ± 4,6 (media + ES) de peso.

Diseño

Se administró de forma contrabalanceada las pruebas conductuales a los tres grupos experimentales mencionados.