No existe relación estadísticamente significativa entre la

3.1

Organotypic culture with thyroxine/triiodothyronine 

In order to assess TH‐associated changes in spinal NOS, a method of culturing the CNS of mid‐

larval (stage 47) Xenopus was developed. After careful staging and selection, anaesthetised animals were 

pinned through the nostrils and lateral to the otic capsules using fine etched tungsten pins, into a Sylgard 

(Dow Corning) surface at the bottom of a glass petri dish filled with frog Ringer’s solution (see Appendix 

1). Using fine dissecting scissors and forceps, the forebrain was cleanly cut away from the rest of the CNS 

and destroyed. The remaining CNS was revealed by gentle cutting and peeling back of the skin and 

surrounding muscle, being careful to avoid damaging the underlying nervous tissue. The underside of the 

CNS was freed by delicately severing all the nerves and roots running beneath it into the tadpole’s body 

using scissors. The CNS was dissected out this way until just caudal to the end of the tadpole’s body, but 

leaving the tail intact and attached to the nervous tissue.  

In each experiment, 5 animals were dissected for each condition (drug and control), transferred to 

their respective petri dishes containing culture medium (see Appendix 1), and pinned securely using 

extra‐fine tungsten pins (Fine Science Tools), one through the midbrain and one through the muscle on 

either side of the tail. This held the CNS firmly in place in the dish, but allowed the tail freedom of 

movement to beat. Once they held 5 samples each, both dishes were placed in a small refrigerator 

maintained at 16‐17°C. Solutions were re‐circulated using a peristaltic pump to move culture medium 

from the larger reservoir into the dish and back. Culture medium feeding into each dish was replaced 

every 24 hours, with TH solution at the required concentration (50nM, 500nM and 1µM for T4 and 1µM 

for T3, see Appendix 1) being made up fresh daily from powder stored in the dark at room temperature. 

The experiment was allowed to run for 72 hours. Before fixation, samples were inspected to ensure they 

had survived in vitro‐ this was verified by gently touching the samples with a blunt probe and seeing 

decomposing, or opaque) or completely unresponsive, even to more aggressive stimulation, were 

eliminated as they were assumed to have died. Approximately 1 in 4 samples were lost this way. All 

remaining viable tissue samples were fixed in cold (4°C) paraformaldehyde (2 to 3 hours at room 

temperature) and then washed (3 x 10min) in cold PB before staining for NADPH‐d. 

3.2

Organotypic culture with an NO donor and a NOS inhibitor 

An organotypic culture method similar to that used in the TH experiments was used to investigate 

NO‐associated changes in Xenopus motor systems. Animals were deeply anaesthetized and a minimal 

dissection was performed (see diagram below): after destruction of the forebrain (1), the dorsal surfaces 

of the midbrain, brainstem and the initial portion of the spinal cord were freed from surrounding skin 

and muscle (2). The cerebellum was removed to improve drug access to the CNS via the central canal. 

The remainder of the spinal cord was left encapsulated in the axial/tail musculature. The ventral surface 

of the CNS was left in contact with cartilaginous tissue below it, and the whole preparation was freed 

from the body by cutting around the otic capsules and just above the thoracic cavity, just until the end of 

the tadpole’s body, where the hindlimb buds are developing (3). This dissection freed the CNS and tail 

from the rest of the body, but kept the tail muscles intact so that swimming could still be observed, 

confirming the preparations were healthy. Samples were pinned into Sylgard dishes using fine tungsten 

pins through the otic capsules, leaving the tail free to move. 

Figure 7. Dissection of stage 47 Xenopus for organotypic culture with nitrergic drugs. The dissection exposes only 

the rostral spinal cord, although as long as the cerebellum is removed, the culture medium should have access to 

the entire CNS via the central canal. Scale bar = 1mm. 

Each experiment involved 5 animals in each of three conditions, two drug conditions (SNAP and L‐

NAME, both at 200µM) and a control. Experiments were maintained at 16‐17°C, and culture medium was 

circulated by gravity‐filling the petri dishes and using a peristaltic pump to remove solution back into the 

reservoirs. Over a 72 hour culture period, drugs were added afresh in bouts of 4 hours, interspaced with 

4 hour bouts of fresh saline (culture medium with no drug or vehicle), excluding a 12 hour period of 

saline at night. This regimen meant that the preparations received drug 6 times over 3 days, for a total of 

24 hours of drug application.  An initial experiment with SNAP showed that when the drug was supplied 

continuously, with reapplication in fresh culture medium every 8 hours, the samples died well before the 

end of the experiment. Therefore the samples were given periods of drug‐free saline in order to recover.  

Figure 8. Administration schedule for organotypic culture with nitrergic drugs. Culture medium (saline) was 

replaced every time the drug was administered, and in between doses. Drugs were applied in 4‐hour bouts. 

The NO‐donor drug SNAP was kindly provided by Professor Anthony Butler of the University of St 

distilled water and when it was used in the culture medium, DMSO was also added to it to control for 

DMSO effects. Likewise, during the period of drug application, the control samples received saline 

containing DMSO at the same concentration as it was for either drug condition (0.2%).