2.3 Evaluación del herbicida linuron sobre B bassiana e I.
2.3.3 Evaluación del efecto del linuron sobre la patogenicidad de
2.3.3.5 Observación de síntomas y/o signos de S.
ambos grupos (tratamiento y control) durante los cuales se observaron síntomas como pérdida de apetito, parálisis, muerte y momificación de los insectos.
2.3.3.6Aislamiento de I. fumosorosea a partir de S. frugiperda
infectados experimentalmente
Se procedió a completar los postulados de Koch, para ello los ejemplares muertos se lavaron dos veces con agua destilada estéril de manera individual sobre la placa de Petri estéril, luego fueron desinfectados con Hipoclorito de Sodio al 2% durante 3 minutos y por último se lavó 3 veces con agua destilada estéril. Posteriormente se retiró el exceso de humedad con papel de filtro estéril y luego fueron incubados en cámara húmeda estéril por espacio de 10 días. Transcurrido este tiempo, con un asa bacteriológica se tomó parte del micelio del hongo y se sembró en placas de Petri con Agar Papa Sacarosa, se incubó a temperatura de 25°C durante 5 días. Por último se realizó una observación microscópica para la identificación.
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2.3.4 Análisis de datos
La determinación del efecto del herbicida linuron sobre B. bassiana e I. fumosorosea, se realizó analizando el porcentaje de germinación y crecimiento de B. bassiana e I. fumosorosea, en las diferentes concentraciones del herbicida, y los datos fueron procesados en base a la prueba de Análisis de Varianza Unidireccional (ANOVA) mediante el programa estadístico IBM SPSS Statistics 22.0.
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RESULTADOS
En la Fig. 1 se observa el efecto del linuron a diferentes concentraciones sobre la germinación de Beauveria bassiana evaluadas a las 24 horas de incubación a 25°C, mientras que en la Fig. 2 muestra el porcentaje de germinación de B. bassiana en diferentes concentraciones de linuron.
En la Fig. 3 se observa el efecto del linuron a diferentes concentraciones sobre la germinación de Isaria fumosorosea evaluadas a las 24 horas de incubación a 25°C, mientras que en la Fig. 4 muestra el porcentaje de germinación de I. fumosorosea en diferentes concentraciones de linuron.
En la Fig. 5 se muestra el efecto del linuron a diferentes concentraciones sobre el crecimiento radial de B. bassiana evaluados a los 10 días de incubación a 25°C; mientras que en la Fig. 6 muestra el porcentaje de crecimiento de B. bassiana frente a diferentes concentraciones del herbicida linuron.
En la Fig. 7 se muestra el efecto del linuron a diferentes concentraciones sobre el crecimiento radial de I. fumosorosea evaluados a los 10 días de incubación a 25°C; mientras que en la Fig. 8 muestra el porcentaje de crecimiento de I. fumosorosea frente a diferentes concentraciones del herbicida linuron a los 10 días de incubación.
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En la Fig. 9 se muestra la larva de Spodoptera frugiperda infectada con I. fumosorosea resembrada en agar papa sacarosa sin herbicida así como la observación microscópica del hongo aislado nuevamente de la larva; además se muestra la larva infectada con I. fumosorosea resembrada en agar papa sacarosa con linuron a concentración de 900 ppm y la observación microscópica de este hongo aislado del insecto.
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Fig. 1 Efecto del linuron sobre la germinación de Beauveria bassiana (40x): A: 0 ppm; B: 900 ppm; C: 5625 ppm; nótese que no ocurre germinación en ninguna de las concentraciones evaluadas.
A
B
C
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Y COMUNICACIÓN
Fig. 2 Porcentaje de germinación de Beauveria bassiana en diferentes concentraciones (ppm) del herbicida linuron a las 24 horas de incubación.
a,b: Letras diferentes nos indican que p<0.05
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 900 5625 100 % 0 % 0 % Ger m in aci ón d e B eau veri a bas siana (% ) Concentración de linuron (ppm)
a
b
b
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Y COMUNICACIÓN
Fig. 3 Efecto del linuron sobre la germinación de Isaria fumosorosea (40x): A: 0 ppm; B: 900 ppm; C: 5625 ppm; nótese que no ocurre germinación en ninguna de las concentraciones evaluadas
A
B
C
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Y COMUNICACIÓN
Fig. 4 Porcentaje de germinación de Isaria fumosorosea frente a diferentes concentraciones (ppm) del herbicida linuron a las 24 horas de incubación.
a,b: Letras diferentes nos indican que p<0.05
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 900 5625 100 % 0 % 0 % Ge rm in ac ió n d e Isa ri a fum o so ros ea (% ) Concentración de linuron (ppm)
a
b
b
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Y COMUNICACIÓN
Fig. 5 Efecto del linuron sobre el crecimiento radial de Beauveria bassiana a los 10 días de incubación a 25°C: A: 0 ppm; B: 900 ppm; C: 5625 ppm; nótese que no ocurre crecimiento en ninguna de las concentraciones evaluadas.
A
B
C
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Y COMUNICACIÓN
Fig. 6 Porcentaje de crecimiento de Beauveria bassiana frente a diferentes concentraciones (ppm) del herbicida linuron a los 10 días de incubación.
a,b: Letras diferentes nos indican que p<0.05
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 900 5625 100 % 0 % 0 % Cr ec im ien to d e B eau veri a bas siana (% ) Concentración de linuron (ppm)
a
b
b
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Y COMUNICACIÓN
Fig. 7 Efecto del linuron sobre el crecimiento radial de Isaria fumosorosea a los 10 días de incubación a 25°C: A: 0 ppm; B: 900 ppm; C: 5625 ppm; nótese que solo ocurre crecimiento en la concentración de 900 ppm.
A
B
C
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Y COMUNICACIÓN
Fig. 8 Porcentaje de crecimiento de Isaria fumosorosea frente a diferentes concentraciones (ppm) del herbicida linuron a los 10 días de incubación.
a,b,c: Letras diferentes nos indican que p<0.05
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 900 5625 100 % 15.24 % 0 % Cr ec im ien to d e Isari a fum os orose a (% ) Concentración de linuron (ppm)
a
b
c
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Y COMUNICACIÓN
Fig. 9 A: Larva de Spodoptera frugiperda colonizada con Isaria fumosorosea procedente de un medio con 0 ppm de linuron. B: Conidias y conidióforo típicas de Isaria fumosorosea (0 ppm) observadas a 40X. C: Larva de Spodoptera frugiperda colonizada con Isaria fumosorosea procedente de un medio con 900 ppm de linuron. D: Conidias y conidióforo típicas de Isaria fumosorosea (900 ppm) observadas a 40X.
A
B
C
D
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DISCUSIÓN
En relación a los datos obtenidos en la germinación de Beauveria bassiana (Fig. 1 y 2) e Isaria fumosorosea (Fig. 3 y 4) se observa que a las 24 horas de evaluación en ambos hongos solo hubo germinación en el control, pero en presencia del herbicida linuron tanto en la concentración de 900 ppm como en la de 5625 ppm hubo un efecto inhibitorio sobre la germinación, esto probablemente se debe a que al momento de realizar la primera fase de la germinación que es el hinchamiento hidrostático que es provocada por el ingreso de agua a la conidia y que junto con este elemento también ingresó el herbicida al interior; dado que durante la germinación la conidia en búsqueda de absorber la mayor cantidad de nutrientes no tiene mucha selectividad de las sustancia en su entorno, lo que ocasiona que la conidia no germine.57
De esta misma manera el porcentaje de germinación en ausencia del herbicida es del 100 %, sucediendo muy lo contrario en presencia del herbicida con el que se evaluó la germinación de ambos hongos en las concentraciones máxima y mínima que su porcentaje es del cero por ciento (Fig. 2 y 4); dado que la germinación de las conidias requiere de un entorno adecuado acompañado de nutrientes y condiciones especiales.58
El proceso de germinación puede ser dividido en tres fases: hinchamiento hidrostático de conidias, la aparición del tubo germinal y elongación del tubo
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germinal.58 El primer paso incluye la conversión de la conidia de reposo, cuya latencia se controla por la presencia interna de bloques metabólicos, las barreras de penetración de nutrientes, propios inhibidores y bajo contenido de agua; un período de hinchazón gradual de la conidia incluyendo aumento tanto en el diámetro y la biomasa.59 La segunda fase, cuando el tubo germinativo emerge de la conidia ampliada cuyo crecimiento se produce con el apoyo de la movilización y la utilización de compuestos de almacenamiento en la conidia. En la última fase ocurre la biosíntesis y la extensión de la absorción y el metabolismo de los nutrientes del medio.59
En la figura 5 se observa la ausencia del crecimiento micelial de B. bassiana en las placas Petri con linuron tanto en las concentraciones de 900 ppm como en la de 5625 ppm, a diferencia de la placa sin químico donde se evidencia el crecimiento normal. Al realizar el análisis estadístico muestra que linuron si tiene un efecto sobre el crecimiento micelial de B. bassiana (Fig. 6).
El herbicida linuron al entrar en contacto con las paredes celulares del hongo produce una hiper-oxidación, el cual provoca la formación de radicales libres en las paredes celulares lo que provoca una inestabilidad de esta y el hongo por buscar la estabilidad rápida en su pared celular termina alterando el ADN de sus células rápidamente lo que conlleva a la destrucción de las mismas; así también ocasiona una inhibición de la fosforilación oxidativa, impidiendo así de esta manera que pueda generar su propia energía, en consecuencia sin ATP generados por la falta de energía
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el hongo no puede producir biomasa, el cual se puede observar macroscópicamente con la no formación de micelio.60
Linuron tiene efecto sobre el ácido ribonucleico del ribosoma provocando como consecuencia la inhibición del metabolismo de las proteínas, impidiendo de esta manera la producción de proteínas, moléculas importantes en la conformación de su pared celular la cual está compuesta por proteínas y polisacáridos, donde ambas se asocian formando glicoproteínas las cuales tiene como función proteger de sustancias extrañas, transmitir señales al citoplasma así como sintetizar y remodelar los componentes de la pared. 61,62
Por otro lado en la figura 7 se observa la ausencia de crecimiento de I. fumosorosea en la concentración de 5625 ppm de linuron, mientras que a las concentración de 900 ppm muestra una disminución del crecimiento en más de 84 % (Fig.8), empezando su crecimiento al octavo día de evaluación, debido a que el crecimiento del hongo varía dependiendo de las características inherentes del hongo y de las condiciones nutricionales y ambientales.57
De esta manera el crecimiento de I. fumosorosea ante la presencia del herbicida se puede deber a una variabilidad genética o al uso de vías metabólicas alternas permitiendo de esta manera la reducción o no absorción del compuesto activo, dado que durante el crecimiento las hifas se vuelven más selecticas en la absorción de sus nutrientes a través de su pared celular, por ultimo también pudo
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deberse a la detoxificacion realizado por el hongo.63 En consecuencia el químico solo tuvo acción sobre el hongo de una manera fungistática y no fungicida como lo que sucedió con B. bassiana.
Debido a que B. bassiana no presentó germinación ni crecimiento en las concentraciones del herbicida evaluadas; ya no se determinó la capacidad entomopatogena de este hongo, lo que no ocurrió en el caso de I. fumosorosea que si presentó crecimiento a las concentración de 900 ppm.
Al evaluar si I. fumosorosea crecía en presencia de linuron a 900 ppm y si aún conservaba su capacidad entomopatogena se encontró que este hongo a pesar de haber crecido en presencia de este químico fue capaz de matar la larva de Spodoptera frugiperda creciendo incluso en la superficie del insecto; no presentando diferencia con I. fumosorosea que provenía de un medio de cultivo sin linuron (Fig. 9).
El hongo I. fumosorosea ha demostrado que no ha perdido su capacidad entomopatogena, esto pudo deberse a que durante el crecimiento ocurrió una variabilidad genética, el uso de vías metabólicas alternas entre otros mecanismo ya anteriormente mencionadas; permitiendo la correcta formación de metabolitos primarios indispensables para el crecimiento y posteriormente la producción normal de metabolitos secundarios.
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Estos metabolitos secundarios son producidos por células que han dejado de crecer o cuyo crecimiento es restringido, es decir presentándose cuando la tasa de crecimiento es menor. Esto se sustenta en que las hifas de los hongos crecen solo en los extremos, y las células más viejas del micelio van quedando atrás, de este modo los metabolitos secundarios pueden acumularse en las partes más viejas de la colonia aun esta sigue creciendo en los márgenes.64 Debido a esto es que I. fumosorosea presenta todo el proceso de ataque y muerte de este insecto, este proceso debería ser como sigue.
El desarrollo de la invasión en el insecto está dividido en tres fases: primero la adhesión y germinación de la conidia en la cutícula del insecto, segundo penetración a la cutícula y por último el desarrollo del hongo, que generalmente resulta en la muerte del insecto. El proceso de adhesión está mediado por adhesinas como el ácido oxálico un metabolito secundario de bajo peso molecular; el cual coadyuva a la solubilización de la proteína cuticular del insecto.65,66
La fase de penetración es posible a la acción combinada de dos mecanismos uno químico y uno físico, en el cual para el primer mecanismo consiste en la acción enzimática de proteasas, lipasas y quitinasas, las cuales degradan el tejido en la zona de penetración, facilitando la entrada del hongo. El mecanismo físico para poder realizar la penetración del hongo es ejercida por una estructura fúngica denominada haustorio, el cual ejerce una presión sobre la capa cuticular, las áreas esclerosadas y membranosas de la cutícula, respectivamente. 65
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En la fase del desarrollo del hongo, I. fumosorosea produce una micotoxina llamada beauvericina, la cual determina la capacidad real del hongo para afectar de manera negativa a la larva y bloquear sus mecanismo de respuesta inmunológica.66,67
La beauvericina provoca en el huésped la degradación progresiva de los tejidos, cambios estructurales de las membranas y deshidratación. Asimismo, se evidencian cambios en la actividad eléctrica de los nervios causada por el incremento del consumo de oxígeno en un intento de la larva por restablecerse.67
En consecuencia, I. fumosorosea ocasiona síntomas fisiológicos anormales en el insecto tales como convulsiones, carencia de coordinación, comportamientos alterados y parálisis. La muerte sobreviene por una combinación de efectos que comprenden el daño físico de tejidos, toxicosis, deshidratación de las células por pérdida de fluido y consumo de nutrientes. Ya en el interior del insecto, este hongo debe enfrentarse con los mecanismos de respuesta del sistema inmune.68
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CONCLUSIONES
El herbicida linuron en las concentraciones de 900 ppm y 5625 ppm inhibe la germinación de Beauveria bassiana e Isaria fumosorosea en condiciones de laboratorio.
El herbicida linuron en las concentraciones de 900 ppm y 5625ppm inhibe el crecimiento de Beauveria bassiana teniendo efecto fungicida sobre este hongo en condiciones de laboratorio.
El herbicida linuron en las concentración de 900 ppm disminuye el crecimiento de Isaria fumosorosea, mientras que a la concentración de 5625 ppm lo inhibe.
El herbicida linuron a la concentración de 900 ppm no afecta la capacidad entomopatógeno de Isaria fumosorosea contra Spodoptera frugiperda en condiciones de laboratorio.
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RECOMENDACIONES
Evaluar en campo el efecto del herbicida linuron sobre Beauveria bassiana e Isaria fumosorosea debido a que se deben analizar otras variables externas que podrían tener un efecto favorable o desfavorable en la acción de este químico.
Determinar el efecto del linuron sobre otros hongos controladores de insectos para de esta manera poder identificar cepas nativas capaces de crecer en presencia de este herbicida sin perder su capacidad entomopatogena.
Al estimar el efecto de los pesticidas como linuron tener en cuenta si estos químicos están actuando como fungistáticos o fungicidas.
Al evaluar en efecto del linuron tener en consideración que este químico es volátil lo cual hace que su persistencia en el sustrato sea menor en relación al tiempo.
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