Para la obtención de las plantas transgénicas de tabaco 35S:A4a y dobles transgénicas 35S:A9/A4a (ver Sección 1.1.1.), se insertó el transgén 35S:HaHSFA4a en plantas de tabaco (Nicotiana tabacum var. Xanthi) silvestres o transgénicas 35S:A9, respectivamente, por transformación con A. tumefaciens.
Para ello, se transformó A. tumefaciens con el vector binario 35S:A4a, y se infectaron con estas células discos de hoja de plantas de tabaco, para la integración del transgén 35S:HaHSFA4a dentro del ADN genómico de la planta. Posteriormente, los discos de hoja se trataron con hormonas de crecimiento y antibióticos, para la obtención de plantas transgénicas completas. Se seleccionaron aquellas plantas que poseían una única integración del transgén, y a partir de éstas, se obtuvieron las correspondientes líneas transgénicas homocigóticas para el transgén
35S:HaHSFA4a, así como sus respectivas hermanas singénicas.
4.1. Construcción del vector binario 35S:A4a.
Para la construcción del vector binario 35S:A4a, se integró una fusión transcripcional del gen
HaHSFA4a unida al tag 3xHA (Hemaglutinina) dentro del vector binario pBIB-Hyg (Becker, 1990):
El ADN correspondiente al gen HaHSFA4a se obtuvo mediante amplificación por PCR a partir del vector binario pBI221:HaHSFA4a (Tejedor-Cano et al., 2014). Para la reacción de PCR se usó la enzima de alta fidelidad Pwo DNA Polimerase (Roche), siguiendo las recomendaciones descritas por el fabricante. En este paso, se introdujo una diana de restricción XbaI (localizada 3 pb antes del codón ATG de inicio de la traducción) y una diana SalI (localizada 5 pb detrás del codón de STOP), mediante los oligonucleótidos 5’-GTTGTTGGTATATCTAGATCAATGATGAATG- ATGTTCATGG-3’ y 5’-GTAAATTTAGACAGTCGACCATTATCAACTTCTCTCTA-CTG-3’ (con una Tm de
67 oC).
El ADN amplificado (1215 pb) se digirió con las enzimas de restricción XbaI y SalI (ver
Sección 2.5.), y el fragmento resultante (1178 pb) se insertó en el vector pUC19-35S:HA, entre las dianas de restricción XbaI y SalI (Tejedor-Cano et al., 2010), generándose el vector pUC- 35S:3xHA:HaHSFA4a. Este paso permitió la inserción del gen HaHSFA4a entre la región
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promotora CaMV 35S y el tag 3xHA, fusionado en el extremo N-terminal del gen, en el mismo marco de lectura.
El vector pUC-35S:3xHA:HaHSFA4a se digirió con las enzimas de restricción HindIII y KpnI, y el fragmento resultante (2284 pb) se insertó entre los sitios de restricción HindIII y KpnI del vector binario pBIB-Hyg (Becker, 1990), obteniéndose el vector binario 35S:A4a.
4.2. Transformación de discos de hoja de tabaco.
Para la transformación de plantas de tabaco con A. tumefaciens se siguió principalmente el protocolo descrito por Horsch et al. (1985).
La cepa de A. tumefaciens portadora del vector binario 35S:A4a se sembró en césped en placas Petri con medio YEP sólido (ver Sección 1.2.1.) suplementado con 50 µg/ml de kanamicina y 50 µg/ml de estreptomicina, y se cultivó a 28 oC durante 48 h. Posteriormente, las células se resuspendieron en medio MS (ver sección 1.1.3.) suplementado con hormonas de crecimiento (0,1 mg/l NAA y 1 mg/l 6BA).
Para la transformación con A. tumefaciens, se usaron plantas de tabaco (Nicotiana tabacum var. Xanthi) silvestres o transgénicas 35S:A9, cultivadas in vitro en contenedores MagentaTM (Sigma-Alrich), en condiciones de esterilidad. Se seleccionaron hojas totalmente expandidas de plantas jóvenes (5-6 semanas) y se cortaron en trozos de aproximadamente 1 cm2, eliminando el nervio central. Los discos de hojas se sumergieron en el cultivo de A. tumefaciens en medio MS
durante 5 min. Posteriormente, los discos de hoja se colocaron, con el haz hacia arriba, en placas Petri con medio MS sólido suplementado con hormonas de crecimiento, y se incubaron en cámaras de cultivo in vitro con luz tenue. Transcurridos 5 días de incubación, los discos de hoja se traspasaron a medio MS sólido con hormonas de crecimiento (0,1 mg/l NAA y 1 mg/l 6BA) y antibióticos: 250 µg/ml de cefotaxina (para eliminar A. tumefaciens) y 45 µg/ml de higromicina (para seleccionar brotes transgénicos). Transcurridos 15-20 días de cultivo in vitro, empezaron a formarse callos en los discos de hoja, a partir de los cuales proliferaron los brotes de plantas transgénicas.
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4.3. Selección de transformantes y enraizamiento.
Los brotes obtenidos de los discos de hoja se separaron del callo y se traspasaron a contenedores MagentaTM (Sigma-Alrich) con medio MS sólido suplementado con hormonas de crecimiento (0,1 mg/l NAA y 1 mg/l 6BA) y antibióticos (45 µg/ml higromicina y 250 µg/ml cefotaxina). En este medio, se seleccionaron los transformantes positivos, los cuales fueron capaces de enraizar en el medio suplementado con higromicina.
Las plantas se mantuvieron en cultivo in vitro hasta que alcanzaron una altura de 5-8 cm. Posteriormente, se traspasaron a macetas con tierra (ver Sección 1.1.4.). Para aclimatarlas al cambio de humedad, las plantas se cubrieron con bolsas de plástico durante unos días.
4.4. Obtención de plantas transgénicas homocigóticas.
Las plantas transgénicas obtenidas tras la transformación, se cultivaron en tierra hasta la obtención de semillas, y se seleccionaron las plantas que presentaban una integración simple del transgén 35S:HaHSFA4a. Para ello, las semillas se sembraron en medio MS sólido suplementado con 45 µg/ml higromicina, y se seleccionaron las líneas que presentaban una segregación mendeliana 3:1 para el transgén.
Una vez seleccionadas las líneas con integración simple del transgén, se seleccionaron aquellas líneas que mejor expresaban el transgén 35S:HaHSFA4a en heterocigosis. Se analizó la acumulación del tag HA en estas líneas por western blot tras electroforesis desnaturalizante SDS- PAGE (ver Sección 8.), y se seleccionaron las líneas con mayor acumulación del tag.
A partir de estas líneas, obtuvimos líneas homocigóticas para el transgén 35S:HaHSFA4a. Las plantas de las líneas heterocigóticas se cultivaron en tierra hasta la obtención de semillas. Posteriormente, se seleccionaron las plantas cuyas semillas presentaban un 100 % de supervivencia en presencia de higromicina. Finalmente, se seleccionaron las líneas transgénicas que mejor expresaban el transgén 35S:HaHSFA4a en homocigosis. Se analizó la acumulación del
tag HA en las plántulas por western blot tras electroforesis desnaturalizante SDS-PAGE (ver