Oligos utilitzats per a la formació de la soca que sobreexpressa BDH1 i FDH1, pel constructe Fdh1-Bdh1(His)6p Les dianes de restricció estan subratllades, i en verd estan marcades les

zones homòlogues per a la recombinació.

A continuació, un dels transformants correctes es va fer créixer en medi líquid SC-Ura, per tal de transformar-lo amb un fragment linear que conté el promotor GAL1 flanquejat per la seqüència -520→ -473 del promotor de BDH1, i per la

seqüència +1→+48 del propi gen BDH1. Aquest fragment s’havia obtingut mitjançant PCR amb els oligos: Pbdh-gal-Fw i Bdh-gal-bis-rv (Taula 1), i utilitzant el plàsmid pYES2-BDH1 com a template. Després de la transformació amb el mateix mètode d’abans (acetat de liti), es van sembrar les cèl·lules en una placa de medi YPD i es van deixar créixer overnight.

L’important ara és obtenir cèl·lules que hagin perdut el doble marcador per recombinació homòloga del fragment amb GAL1. Per a la selecció d’aquestes cèl·lules, l’endemà es fan una rèplica d’aquesta placa en medi SC que porta addicionat 5-FOA (àcid 5-fluoroorotic). Les colònies que creixen en aquesta placa no tenen teòricament l’insert amb el doble marcador, ja que el gen URA3 codifica per l’enzim orotidina 5’-fosfat descarboxilasa, que converteix el 5-FOA en 5-fluorouracil, que és un compost tòxic que causa la mort celular. Per descartar el cas que les cèl·lules no hagi integrat el promotor GAL1, i per tant encara tinguin el doble marcador, però hagin succeït mutacions espontànies en el gen URA3 que permetessin viure a les cèl·lules en el medi amb 5-FOA, es fa una replica d’aquesta placa en una altra amb medi YPD amb clonNAT, on no hi podràn créixer les cèl·lules que hagin perdut el marcador natMX4. La selecció dels transformants es fa per contra selecció, és a dir, les colònies que creixin en el medi amb 5-FOA, però no creixin en el medi amb clonNAT, són les que han integrat el fragment del promotor GAL1 (Figura 28).

Els diversos transformants es van verificar mitjançant PCR amb els oligos o- gal1-fw i o-bdh1-rv (Taula 1), i posteriorment un d’ells per seqüenciació.

Aquesta nova soca (WV36-405 bdh1::PGAL1-BDH1), va ser transformada

finalment amb el plàsmid pYES2-FDH1, i seleccionada de plaques amb medi SC-Ura, obtenint així una nova soca de llevat anomenada DP-BDH1, que sobreexpressa Bdh1p (a nivell cromosòmic amb el nou promotor GAL1), i Fdh1p (a nivell plasmídic amb el mateix promotor GAL1 que conté el plàsmid), si creix amb galactosa. Els extractes i les cèl·lules permeabilitzades utilitzades en aquest

estudi, provenen d’aquesta soca crescuda fins l’inici de la fase estacionària en medi SC-Ura amb el 2% de galactosa.

PBDH1

URA3 Nat1

Figura 28. Procés total per l’auto-clonació. S’observa l’entrada del doble marcador en el lloc del

PBDH1 en primer lloc, i la posterior curació amb l’insert PGAL1.

Formació de la proteïna de fusió (FDH1p-Bdh1-(His)6p)

El gen de la formiat deshidrogenassa (FDH1) de S. cerevisiae va ser amplificat mitjançant PCR a partir de ADN genòmic del llevat, amb els oligonucleòtids o- FDH-fw i o-FDH-rv (Taula 1). S’utilitzà un gel d’agarosa per tal d’obtenir els

BDH1 URA3 PBDH1 Nat1 BDH1 PBDH1 BDH1 URA3 Nat1 BDH1 PBDH1 PGAL1 BDH1 PBDH1 PGAL1 BDH1 PBDH1 PGAL1 BDH1 URA3 Nat1 BDH1

amplificats, que un cop recuperats del gel, van ser digerits amb els enzims de restricció BamHI i EcoRI, juntament amb el plàsmid pYES2. Finalment, la lligació d’ambdós ens permet tenir el gen clonat en el vector, obtenint el constructe pYES2-FDH1. Aquest va ser seqüenciat per tal de verificar que durant la reacció de la PCR no s’haguessin introduït mutacions en la seqüència del gen. Per a l’obtenció de l’altre constructe necessari, pYES2-BDH1-6His, es va utilitzar el mateix mètode. Així, aquests dos constructes són el punt de partida per a l’obtenció del constructe d’interès pYES2-FDH1-BDH1-6His, que espressa la proteïna de fusió desitjada. Aquesta proteïna està formada per la Fdh1p en l’extrem N-terminal, i la Bdh1-(His)6p en l’extrem C-terminal, unides pel pèptid

ENLYFQG com a linker.

El constructe que codifica la proteïna de fusió (Figura 29), es va obtenir en tres passos, consistents en tres reaccions de PCR.

Figura 29. Constructe de la proteïna de fusió FDH1-BDH1-6His

En primer lloc, una PCR amb els oligonucleòtids o-FDH-fw i FPint-Rv (aquest és el que introdueix el linker) (Taula 1) juntament amb el constructe pYES2-FDH1 com a template. Amb aquesta reacció s’obté un fragment que conté el gen FDH1 fusionat amb el gen que codifica el pèptid linker.

En segon lloc, es duu a terme una PCR amb els oligonucleòtids FPint-Fw i bdh1- his, juntament amb el constructe pYES2-BDH1-6His com a template, de la que s’obté un fragment en el que hi ha fusionats els gens BDH1-6His i el que codifica pel ja anomenat linker.

Finalment, la darrera PCR en la que s’utilitza una mescla d’aquests dos fragments com a template, que contenen una regió complementària (en color verd en els oligos de la taula 1), juntament amb els oligonucleòtids externs o- FDH-fw i bdh1-his, de la que s’obté el gen complet que codifica per la proteïna de fusió Fdh1p-Bdh1(His)6p.

6 his Linker

I,

ionats per auxotrofia en medi SC-Ura, gràcies al gen URA3 del làsmid.

uta

utació ha introduit els aminoàcids D201A, K206A en aquesta mateixa posició.

rans com Un cop obtinguts els amplificats de la última PCR, es carreguen en un gel d’agarosa per tal d’obtenir-los purs. Un cop retallada la banda del gel que els conté, i recuperats, es digereixen amb els enzims de restricció BamHI i EcoR juntament amb el plàsmid. Un cop clonats, van ser verificats per seqüenciació. Els plàsmids amb el constructe correcte, s’introduïren a la soca de llevat mitjançant el mètode de l’acetat de liti (Ito et al. 1983), i els transformants van ser selecc

p

M nts de Adh1p i Adh3p

En aquesta part de la Tesi es pretén introduir mutacions puntuals en la seqüència aminoacídica d’Adh1p i d’Adh3p, amb la idea inicial d’aconseguir mutants depenents de NADPH (ambdós enzims són depenents de NADH), i mutants incapaços d’utilitzar cap dels 2 coenzims. Així, s’han introduit dos tipus de mutacions en els gens ADH1 i ADH3: en una d’elles s’ha canviat una seqüència implicada en la unió al NAD(H) (D201S, G202R, G203S). S’ha triat aquesta seqüència perqué és un dels determinants de la preferència d’Adh6p per NADP(H) (Valencia et al. 2004). L’altra m

Per a l’obtenció d’aquests mutants d’Adh1p i Adh3p, s’ha utilitzat una variant de la tècnica del delitto perfetto (Storici et al. 2001). desenvolupada al nostre laboratori (el doble cassette URA3- natMX4). A diferència dels altres exemples de la Tesi en els que es clonaven gens sencers, o trossos g

promotors, en aquest cas només es varen introduir mutacions puntuals.

La tècnica consisteix, bàsicament, en dos passos: primer s’insereix el doble marcador URA3-natMX4 en el lloc d’interès, que en aquest cas es una part de ADH1 implicada en la unió a NAD(H). A continuació es “cura” la part mutada inserint-hi el gen ADH1* amb la mutació desitjada (Figura 30). Després de la

selecció de transformants adh1:: URA3-natMX4, es va amplificar un fragment de ADH1 amb la mutació desitjada: es dissenyen 4 oligonucleòtids, dels quals 2 seran “interns” i els altres 2 “externs”. Els interns hibriden a la seqüència del gen que flanqueja la zona que es vol mutarincorporant la mutació desitjada. Els externs, hibriden a l’exterior de la regió a mutar i permetran la recombinació posterior. Els oligos emprats pel procés amb ADH1 estan a la taula 2, mentre que

roduides es varen comprovar per sequenciació dels gens ADH1* mutats.

finalment, l’inserció del gen mutat al lloc que ocupava inicialment en substitució del doble marcador.

els utilitzats en el procés amb ADH3 estan a la taula 3. Les mutacions int

Figura 30. Obtenció d’un mutant d’ADH1. A la figura s’observa el procés global per a l’obtenció d’un

mutant d’ADH1. Per un cantó es veu l’amplificació del doble marcador i posterior inserció al cromosoma en el lloc d’ADH1, gràcies a recombinació homòloga. Per l’altre, es veu l’introducció de la mutació al gen deguda a l’acció combinada dels 4 oligonucleòtids. I,

ADH1 ADH1 ADH ADH ADH1 URA3 Nat1 ADH1

ADH1 _{URA3 Nat1} ADH1

ADH1

ADH URA3 Nat1 ADH

URA3 Nat1

ADH1

Per amplificar [URA3_nat1] i substituïr el gen (ADH1) ADH1-FOA-NAT fwd: TCAAGCTATACCAAGCATACAATCAACTATCTCATATACACAATACAACAGATCACGTG ADH1-NAT-FOA rev: CTTATTTAATAATAAAAATCATAAATCATAAGAAATTCGC

Per obtenir l’insert ADH1 mutat

Externs per curació:

adh1-cur-fwd:

TCAAGCTATACCAAGCATACAATCAACTATCTCATATACAATGTCTATCCCAGAAACTCAAAAAG

adh1-cur-rev:

CTTATTTAATAATAAAAATCATAAATCATAAGAAATTCGCTTATTTAGAAGTGTCAACAACGTATCACC

Interns per mutació SRS:

adh1-SRS1:

GTCTTGGGTATTTCTAGATCTGAAGGTAAGGAAG

adh1-SRS2:

CTTCCTTACCTTCAGATCTAGAAATACCCAAGAC

Interns per mutació NiNi:

adh1-NN: A1-AA1:

GAGTCTTGGGTATTGCCGGCGGTGAAGGTGCCGAAGAATTATTCAGATCC

adh1-NN: A1-AA2:

GGATCTGAATAATTCTTCGGCACCTTCACCGCCGGCAATACCCAAGACTC