3.2 Mètode estàndard: Seqüenciació Sanger
3.2.2 Optimització de la tècnica amb teixit tumoral inclòs en parafina
El teixit obtingut per cirurgia o com a biòpsia es va fixar en formol per imbibició i es va fer un bloc de parafina del que, mitjançant un micròtom, es van fer talls de poques micres de gruix que es van adherir en un portaobjectes. Aquests portaobjectes, amb les seccions de teixit adherit, es van tenyir, en aquest cas amb hematoxilina-eosina, per tal de visualitzar i distingir els tipus cel·lulars de la mostra.
Fig. 24. El teixit inclòs en parafina es va tallar amb un micròtom per tal d’aconseguir seccions de poques micres de gruix. Aquests talls es van muntar en un portaobjectes i es van tenyir amb hematoxilina-eosina per tal que un patòleg valorrés les àrees tumorals per a la seva posterior microdissecció.
Per microdisseccionar el teixit calia que aquestes seccions, també tenyides amb hematoxilina-eosina, quedessin adherides a la membrana d’un portaobjectes especial que permetia que les àrees microdisseccionades fossin catapultades pel làser de l’aparell. Les instruccions de treball estan adjuntes en l’annex I (instruccions III, IV i V).
Fig. 25. Microdissecció de les àrees tumorals d’un teixit inclòs en parafina. En la primera imatge, que correspon a una secció del teixit tenyit amb hematoxilina-eosina, es poden apreciar les zones tumorals que són “retallades” pel microdissector. Aquestes àrees són catapultades per un pols de làser al tap de l’eppendorf on hi ha el tampó corresponent.
Es va treballar amb dos tipus de mostra:
1. ADN de teixit tumoral inclòs en parafina de pacients amb CPCNP. Les seccions de 4µm, tenyides amb hematoxilina-eosina, van ser avaluades per un patòleg que va marcar les zones amb més concentració de cèl·lules tumorals. Generalment, es van microdisseccionar 0,7mm2 de teixit tumoral.
2. ADN de mostres amb poca cel·lularitat tumoral de pacients amb CPCNP. Una mostra es considera que té poca cel·lularitat tumoral quan l’àrea de la neoplàsia és inferior a 0,7 mm2. Es procedeix de la mateixa manera que per a les mostres anteriors.
Microdissecció Micròtom
La poca quantitat tumoral obliga a microdisseccionar, generalment, una àrea de només 0,12mm2 de teixit.
3.2.2.1 Extracció de l’ADN
1. Teixit tumoral inclòs en parafina
Les àrees microdisseccionades recuperades en un eppendorf amb 200µl de tampó de digestió, es van incubar durant almenys 16 hores a 60oC per tal que la proteïnasa K, que conté el tampó, digerís el teixit i s’alliberés l’ADN cel·lular. A continuació es van afegir 10µl més de proteïnasa K, per acabar de digerir el teixit, i es procedí a l’extracció d’ADN amb fenol-cloroform-alcohol isoamílic. La instrucció de treball es troba adjunta en l’annex I (instrucció VI).
2. Mostres amb poca cel·lularitat tumoral
La minsa quantitat de tumor va comportar que no fos viable l’ús de les tècniques d’extracció d’ADN convencionals. Es van digerir les mostres en 20µl del tampó d’amplificació de l’ADN per PCR. En la següent figura es pot veure el procés de microdissecció d’aquest tipus de mostra.
Fig. 26. Microdissecció de les cèl·lules tumorals d’una mostra de teixit inclòs en parafina amb poca cel·lularitat neoplàsica. En la primera imatge, que correspon a una mostra tenyida amb hematoxilina- eosina, es pot apreciar un grup de cèl·lules. Un cop identificades són “retallades” pel microdissector i catapultades per un pols de làser al tap de l’eppendorf on hi ha el tampó corresponent.
En aquest tampó s’havia afegit proteïnasa K per digerir les membranes cel·lulars i alliberar l’ADN. La incubació amb el tampó va ser de 5 a 16 hores a 60oC. Tot seguit es va realitzar un xoc tèrmic per inactivar l’enzim.
3.2.2.2 Amplificació per PCR
Per amplificar l’ADN del teixit inclòs en parafina es va partir de les condicions optimitzades de PCR per a l’ADN de limfòcit i de les línies cel·lulars.
Es va comprovar que amb una sola amplificació no s’assolia la intensitat de banda suficient com per poder seqüenciar els exons 19 i 21 amb èxit. Calia reajustar els cicles de PCR i realitzar una reamplificació o nested (reamplificació de l’ADN que ja ha estat amplificat en una PCR prèvia).
Mantenint les condicions d’amplificació ja posades a punt, es va optar per disminuir els cicles de la primera PCR a 20 i 25 repeticions. Per optimitzar la nested PCR es van combinar dues temperatures d’annealing (62oC i 64oC) amb dos cicles de repetició diferents (35 i 40 cicles). L’esquema de treball es pot veure en la següent taula.
Taula 7. Ajust de les condicions de la nested PCR de mostres de teixit inclòs en parafina mantenint les concentracions dels reactius ja optimitzats.
2. Mostres amb poca cel·lularitat tumoral
Paral·lelament, es van modificar les condicions d’amplificació de les mostres de teixit inclòs en parafina amb poca cel·lularitat tumoral per la baixa concentració d’ADN. Es va augmentar la concentració del MgCl2, del tampó de PCR i les unitats de l’enzim polimerasa. Per una altra banda, es van provar dues temperatures d’amplificació per ajustar l’astringència de la reacció (62oC i 64oC) i dos cicles d’amplificació (20 i 25 cicles). A continuació, per optimitzar la nested PCR es van combinar dues temperatures d’annealing (62oC i 64oC) amb dos cicles de repetició diferents (35 i 40 cicles). L’esquema de treball va ser el següent.
A B
Taula 8. Ajust de les condicions d’amplificació de mostres de teixit inclòs en parafina amb poca cel·lularitat tumoral. En A es descriuen les condicions per a la primera PCR mentre que en B es descriuen les de la nested PCR. TemperaturaoC Nº de cicles 62 35 40 64 35 40 Temperatura oC Nº de cicles 62 20 25 64 20 25 Temperatura oC Nº de cicles 62 35 40 64 35 40
3.2.2.3 Electroforesi en gel d’agarosa
Després de la PCR es van visualitzar les bandes d’amplificació per electroforesi en un gel d’agarosa a l’1% tenyit amb SYBR® Safe (INVITROGEN), tal com es descriu en la instrucció IX de l’annex I.
3.2.2.4 Purificació per digestió enzimàtica
La purificació del producte de PCR es va fer per la digestió enzimàtica conjunta de l’exonucleasa I i la shrimp alcaline phosphatase, tal com es descriu en la instrucció X de l’annex I.
3.2.2.5 Reacció de seqüenciació i precipitació
Es va afegir un volum d’entre 1,5µl i 4µl del producte purificat a la reacció de seqüència depenent de la intensitat de la banda d’amplificació observada en el gel d’agarosa.
La precipitació es va realitzar amb acetat de sodi, EDTA i etanol. Tot el procés es va fer tal com es descriu en la instrucció XI de l’annex I.