Optimización de las PCRs Súper Múltiple

Después de la evaluación de los microsatélites, se descartaron aquellos marcadores que no amplificaron, los que tuvieron baja variabilidad genética y aquellos valorados negativamente según el

GremmProtocol. Finalmente quedó un grupo de 79 marcadores que se consideraron adecuados, al que

se le denominó Radal. Sus secuencias, el número de acceso al GenBank y los fluorocromos se muestran en la Tabla 2.1. A partir de estos marcadores, se diseñaron dos PCR Múltiplex, llamadas SMsa1 y SMsa2 (SúperMúltiplex Sparus aurata). El número de marcadores incluidos en cada PCR múltiplex fue el más alto posible teniendo en cuenta su grupo de ligamiento (para que no se repitiera en la misma reacción), rango alélico y color del fluorocromo (la distancia mínima entre marcadores con el mismo color fue de 18 pb para evitar solapamientos). Inicialmente, la concentración de los cebadores en cada PCR múltiplex fue de 0,2 μM, y se fue modificando hasta que las bandas de los alelos tuvieran alturas de entre 600 y 3000 RFU tal y como describieron Navarro et al. (2008). Aquellos marcadores microsatélites que no amplificaron en las PCRs múltiplex se reemplazaron por otros.

Toda esta puesta a punto de las múltiplex se realizó sobre las muestras de prueba. Las condiciones de la PCR fueron las mismas que las utilizadas en las PCR simples ya descritas. Una vez más, previo a la carrera en el secuenciador automático, se comprobó la adecuada amplificación de los amplicones, mediante una electroforesis en gel de agarosa al 2% durante 30 min (8v∙cm−1_{). Las}

condiciones del secuenciador automático fueron también las mismas que las de las PCRs simples excepto que los productos de la reacción se diluyeron al 50-85% dependiendo del secuenciador utilizado en cada laboratorio.

Los electroferogramas se analizaron usando el programa GeneMapper (v.3.7) utilizando dos kit

de set de bins creados específicamente para estas reacciones (kit-SMsa1 y kit-SMsa2), los cuales están

disponibles en [email protected] y son una especie de macros que incluyen los rangos alélicos de todos los marcadores de una múltiplex permitiendo su lectura automática.

Materiales y Métodos

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Tabla 2.1. Radal: Listado de marcadores microsatélites seleccionados como adecuados en este estudio: código interno (CI), nombres de los loci, número de acceso al GenBank, fluorocromos y secuencias de los cebadores.

Todos los marcadores fueron descritos originalmente por Franch et al. (2006), excepto los que se indican con un asterisco (Argyrokastritis et al., 2002), dos asteriscos (Brown et al., 2005b) o tres asteriscos (Batargias et al., 1999).

CI Locus Acceso Secuencia del cebador forward (5′→3′) Secuencia del cebador reverse (5′→3′)

5'6-FAM

B 1 CId-24-H DQ851306 AGATCCCTCACTGCAGCAAA gtttAGTCTGCATGTTTATATGAGAGCAA B 3 Gt57 DQ851386 CCTGACTCTTACCCCAGTCG gtttAATTACTCCTGTGCTGCATTCTG C 1 DId-14-H DQ851338 CCTTGAAAAGGACACTCACTGATAG gtttATCCCGCTGTCCGAATGA C 2 Fd-48-F DQ851374 ATTACAGCCAGAGGACTGGAGAG gttTCAGAGAGAGTGTTCTTGTGTATCTG C 3 EId-39-T DQ851367 GAACTGTGTGAGAGAGGACAGTTG GAAGGAAAAATTCTGATTGGAGTTC C 4 Saimbb16 AJ418652* ACCTGTTTCTTTGATTTGTTGC gtttCATAACAGCAGGATAGGTCAGACT D 2 Saimbb26 AJ418656* CAATGGCAAAAGCAATGG gtttAAGTGACGACGCAGTGTGA D 4 P3 DQ851284 GAGGGGACACGTAAATTTGG gtttAACAACAGTCAAATGCTGAGTTGT E 1 Bd-68-T DQ851270 AGGGGCGTTTCAGGTTCT gtttAGGTGAGTCCGTCAATCAGTGTAT E 3 Fd-81-F DQ851377 GGCTGGACATGCTTTCATAGAT gtttAGCGCTTGAAGATAAAACAACTCT F 1 Bt96 DQ851295 TCCAGCTTGGGATCAATAAAGTA GCTAGTTTTCCTGAAACAGTCATTT F 2 CId-26-H DQ851307 ATGTGAAACAGAGTGGAAGAAAAAC gtttAGACGACAGACAAAGACCACAGT G 2 CId-03-F DQ851301 ATGACTAAACATCACGTTCATGGAT gtttAGCTCATGGCTAACTGTGTACTTTT G 3 Hd-23-T DQ851391 TCTAACTTTCTTTGAGGTCCCTCTT GAGGACAAGCTGAAGTACGAGTC H 1 P19 DQ851285 GGATCTGCAATATCCACAGTCAG gtttCTGGATGCAAAGCTTTCTCTG H 2 Dd-56-F DQ851326 GTAGTGCTGGAACAAGACCAAAAG gtttCGTCATCCAAAAATCTTTATCTCTC

I 2 Fd-78-H DQ851375 CATTTACAGCTAATGCTCAGAGAAA GTGACTGAAGACAGGTATGAGCAC J 1 P96 DQ851292 CGCAATTAGAAGTAGGAGACTGG gttTGCCAGATGCAGGATGTAAG J 2 DId-24-T DQ851343 AGAGAGCTTCACTGACCCTGAG GCTGAAAACGTGGTTTTGTTAGATA J 3 Bd-06-H DQ851259 GGCATCAGCAGCAACCAG gtttAGGTAAATACCACCGCTGTCAC K 2 Dd-84-H DQ851331 GGGTGATGAATTCGTTGGAC gttTCCTCTTTCAGACACATTACTCACA K 3 EId-13-H DQ851361 CTGACAAATCTGAAGATCTGAATACTG GATCCTCTGCTCATCCATCTG

5'NED

A 5 Bt-14-F DQ851293 AGCCGAGTACTTCTACTCCTCTGAT gtttAGTGAGGGCGGACAGATAAAG B 6 Dt23 DQ851346 ACACAACACACGATTACAGCAGA gttTCCATGTGAGATGTCACTCTATTTC D 6 Fd-42-T DQ851372 TCCAAGAGTGTGAGCAGTCTAATCT gtttCAGGTCCAACCTGCTATCAATTA E 4 BId-18-F DQ851280 AGTGATGCGCTCTGGGTTTTA GTCTCTCAGCCTTTGAAGTGTTATC E 5 Ef6 AJ418667* AGAACAAATGAACTCAGCAACTTTC gtttAGTCTCCTGTGTTTATGATGACTGC E 6 Sai21 AY322112** TCAGAGCAGAGCTGTGATTGTAT gtttACCGAAGCTGATTGTTAGTGTGAGT F 3 Saimbb25 AJ418675* AGGAAGATGACAGTGGAAACATTAG gtttCCCCTACCTTTTCTCTTCTAACTCA G 4 CId-14-F DQ851304 ATGTGAGTGCACACGTGGAG gtttCCTGTCAGGTATATGAGAAGAACTAATG G 5 Gd-67-H DQ851383 CAAGCTCAGGTGTAGCATTAGTCTT gtttAACTGGTTAGGAGTGTTGCTAAATG H 4 B26b DQ851254 TTGACTTGACCCAATATCTCACTCT gttTCTCAGGTGACTAACAAGTGAACAG H 5 Hd-15-H DQ851390 CTCTCTCATGCGCACTTTCTT gtttCACTCCCTCTGATTTATGAGATGAT I 4 Bd-08-F DQ851260 GAGACAGCAGGTCGCTCATC GACAGAGACTAAAGCTCGACGAA J 8 Bd-48-T DQ851265 CAGGGAAACAACACAATGCTG gtTTCCGACAGGTTGTACATATATCAG J 9 Fd-46-T DQ851373 ATTTGACTTGATGATCAGCTGTG gTTTTCTGGAGTATGACTGAAAGACA K 7 CId-65-H DQ851315 ATTTATACCACAGCTCAATGACACC gtTTCCTTCTCGTTTATGTAAGTCTGC K 8 SAI15 AY322110** CTGTCTTTCTGTCCCTCACACTTAT gtttCTCAGTTGAAGCATTCTGTAAAGTC M 5 Ct27 DQ851320 GAGACAGAGAGGAAGAAAAAGGATT gtttCAATGCTACAAGCTGCCTCAG M 6 Fd10 DQ851370 ACCACTCAACAATGACAGGCTAGT GGGATCTGAAACATGAGAGAAGAC M 7 Saimbb20 AJ418655* GCTGTCTCTACGCTTTCAGCTC gtttACTTTGCATTTCCCTGCCTAT

5'PET

A 8 C90b DQ851299 ACAGAGTCAAGCAGCGGATAAC gtttCGACCTGCTGAGGAGAACA A 9 Ad-07-H DQ851247 AGATTACTTAGTCCTAACTGTGGTAGTGA gtttCTTCTTCTGTCTGTCCTTTCACG B 8 Hd-33-F DQ851394 TGAGTCTACAAAGCCAGAACCA gttTAAGAGAATAAAGCTCTGCCTGTGC C 9 Id-39-H DQ851407 ACCAAACAGACAGCTGAAGGTTAC gtttACATTTAGAAAAAGGGAGGATCG C 10 EId-38-F DQ851366 TCTGAATAAAACATTGTCTGCAGTG gtttCTCAGACGGAGTATTTTTGGAACA

D 9 CId-44-T DQ851312 CTTTGACTCCTGACCTCTTAATCC gtttCAGAGTCAGTTCCTTTCCTCTCTGT D 10 SAGT26 Y17266*** GGTTCAGTTTGGAGTATGTTTGAA gttTCAGCTATAGAGATGTCTGTGTTCTC

E 8 Hd-70-H DQ851399 TACACACACACTCTCTCTCTTCAGG gtttATGGAAGAGGCAGGAATCTTTT F 4 P54 DQ851289 TGTCTCTCTATTGTCCTCTCTCCTC gttTGCACCTACAGCGGCATC F 5 Id-11-H DQ851402 GAATGTCTGTAATTGTTTGCGTGT GGTCAATTCAACATATCATCCATC F 6 Hd-25-F DQ851392 AACGGTGTCCTCTATTTCCATTATT GCAGGAATTATCTATGTCTGCCTAA G 6 CId-52-T DQ851314 GTAAATCCAACAATGTAGAGTGACG gttTCCTATTAACATGAATGAGGGTGTT G 7 EId-11-H DQ851360 TGAAAATCACACAACTGGATGC gtttAGAGAGCAGAAGAAGAGACGAGTTA H 6 DId-09-F DQ851336 TATTAGCGCGTAAATGTAGGTTCTT gtttCTGACAAGAGGCTGACAGGAG H 7 DId-07-H DQ851335 CGACAACAGTCAGGAGTAACAGAT GCCTGGTCACCCTGAAAC

I 5 CId-71-T DQ851316 GCGGTGAAGACTACCTTGAATACTA GTGTGTTGACAGAAAATGTACAGGA I 6 Bd-58-F DQ851267 GGGATAATAACCTGTAAGTGAGCAA gtttCAATGTTCCCACTCACATCC J 10 CId-11-T DQ851303 CGTGTGAAGTTGTGTTAAGTTGTG GATGGACACGGTGGTTTAACA J 11 Ad-54-F DQ851243 GTGCATTCAATTGACAGAAAGAGAT gtttCAACAGTGTCATTGTGCTGGAG L 11 DId-16-F DQ851339 GTTGTAGATCGGAGTGTGATAACG gttTGCTCCGAGTAAGCCATATGTA

M 9 Hd-45-F DQ851396 ACATACACCAGGCAGGCATAG GTTGGAAATAGCATTTGGGACTT

5'VIC

A 11 Dd-16-T DQ851323 ACACACATTTAGGGCACCATATC gtttAGATTGCGGAAGAAGTATGAGAGAC A 12 Ad-12-F DQ851239 GAGCCATTTCAGTTTTTATTGGTTC GCCATCCAGCTGGTCCTC

C 12 Dt47 DQ851347 TGCCTCTCTTTCACTCACTTCTC GCACATTGCTCCACACAGAG D 11 CId-29-T DQ851308 GCTCAGCACTACTTTAGTGTTTTGG gttCTGCAGGGAGGAAACAAGAC D 12 EId-41-H DQ851368 GATTCCCATCGTTTGTAAAGTTGAT GAGGACGACCTCAACCTCATAC D 13 Saimbb18 AJ418632* GTCAGTGATGACATACAGATCACCT gtttAGTTCAACTTAAAAAGGGCAGAGTT

E 9 Fd-92-H DQ851379 TAGAGAAAGGCATTTTGTCAATGAG GCATCAGACAGACGGGTACAGT F 7 Hd-77-F DQ851400 CATGTGTTGTTTGTTTGTCAGAGTG gtttCAACATACATGCATACTGAGGAAAG G 9 DId-31-H DQ851345 AACAAACAGCGTTGTCTCAGAAC GAAACCTAAGGCCTCATTTGG H 8 P60 DQ851290 ATGCTGACATAACACAATGTAGCTC GAGAAGTGAGGGGATACCTGAG

I 7 Fd-90-H DQ851378 CAGACTGAGGAGATGGAGGAGAC gtttAGACTCTGTGTTTGGTACAGCAGAT I 8 B13b DQ851252 ATGACAGTGTTTGAGCTCAGTGTTA gtttCCTGCATTCCAGCTTCAGAT I 9 At37 DQ851250 GGTTAGGGTAATCAGAAATGCAATG gtttCTTCTCCAGTCACGATCAATAAAG K 4 EId-08-H DQ851358 CTGTTGACGTGGTACTGAATACATC GGAAAGTTCTGAAAGAATAAGAACC K 6 B82b DQ851257 GCAGAGCAGTGGAAGCAAG gttTCCCCTCTCCTGTGTCTTTTACTA M 3 BId-04-F DQ851276 GATCTCATTATGACGGATCATTAGC gtttATCTTTGTCCGCATGTTTCAC M 4 DId-22-F DQ851342 GGTCAGATAGTTCAGTCATGGATTC gtttCTCCCCTCTACCTCCCAATAAGT

Desarrollo de nuevas PCRs Múltiplex

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2.2.4 Genotipado y Asignación Familiar

Cuatro laboratorios españoles de genética en acuicultura genotiparon las muestras control con la SMsa1 y la SMsa2, utilizando los kit de set de bins, para validar la robustez de las mismas en el genotipado. Para probar la utilidad de ambas múltiplex en la asignación parental, se genotiparon con la SMsa1 los tres lotes de reproductores y su descendencia, mientras que con la SMsa2 sólo los reproductores del ICCM y sus descendientes. Cada lote de reproductores se genotipó en un laboratorio diferente utilizando el GeneMapper (v.3.7) y el kit de SMsa1-bin. Cada carrera de muestras para genotipar contenía una de las muestras control que se utilizó como muestra de referencia (Ref-sa), disponible si se solicita a [email protected]. Las asignaciones familiares se determinaron utilizando los genotipos de cada múltiplex PCR de manera independiente.