Organelos de superficie

Aunque el A. pleuropneumoniae había sido descrito como no motil e incapaz de producir apéndice locomotores, Negrete-Abascal et al. (2003), demostraron la presencia de estructuras polares emergentes de las superficies celulares bacterianas (Figura 1b, c) involucrados en la motilidad bacteriana in vitro, compuestas por

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proteínas de 65 KDa y una identidad del 100% en sus secuencias aminoacídicas N- terminales con las flagelinas de otros patógenos gram-negativos. Por otro lado, la presencia de fimbrias tipo IV (Tfp) han sido identificadas por microscopía electrónica exhibiendo una arquitectura común de proteínas cuyo promotor presenta una organización genética de 4 genes contiguos; apfABCD (Zhang et al., 2000; Boekema et al., 2004), similar a la de bacterias relacionadas. La presencias de estos apéndices extracelulares se relaciona directamente con la adherencia, colonización y supervivencia del A. pleuropneumoniae en el tracto respiratorio del porcino.

2.3.4.6 Quorum sensing

El Quorum sensing es un término que describe la comunicación entre bacterias dentro de una población, basada en la secreción de pequeñas moléculas que funcionan como autoinductoras para tomar decisiones colectivas (Boyen et al., 2009). Estas moléculas y genes codificantes para los componentes del Quorum sensing, han sido reportadas en el A. pleuropneumoniae donde están involucrados en la formación de biofilms. En los trabajos de Buettner et al. (2008) y Li et al. (2008), se demostró que la deleción en arca y luxS; respectivamente, de vital importancia en la formación de biolfilms en muchas especies bacterianas que los utilizan para adherirse al órgano blanco, actúan en detrimento del crecimiento bacteriano, sugiriendo que son un factores de regulación importantes para diferentes comportamientos incluyendo la formación de biofilms.

Como importante factor de virulencia contribuyendo a la colonización del tejido blanco en el hospedador, esta formación de biofilms en el A. pleuropneumoniae fue recientemente reportada como prevalente en aislados de campo (Kaplan and

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Figura 2. Representación gráfica del genoma circular del A. pleuropneumoniae, aislado JL03. Los círculos están numerados del 1 (círculo externo) al 10 (círculo interno). Todos los genes están coloreados de acuerdo a su función biológica: oro para traducción, estructura ribosomal y biogénesis; naranja para procesamiento y modificación del RNA; naranja claro para transcripción; naranja oscuro para replicación, recombinación y reparación del ADN; blanco opaco para división celular y cromosomal; rosado para mecanismos de defensa; tomate para señales de transducción; pera para biogénesis de envoltura celular y membrana externa; rosado profundo para tránsito intracelular, secreción y transporte vesicular; verde pálido para modificaciones post-traduccionales, rotación de proteínas y chaperonas; azul rey para producción y conversión de energía; azul para metabolismo y transporte de carbohidratos; azul gandul para metabolismo y transporte de aminoácidos; azul cielo para metabolismo y transporte de nucleótidos; azul claro para metabolismo de coenzimas; siena para metabolismo de lípidos; morado para metabolismo y transporte de iones inorgánicos; aguamarina para biosíntesis, transporte y catabolismo de metabolitos secundarios; gris para función desconocida (Xu et al., 2008).

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a. apxI apxII apxIII Serotipos

b. apxIVA

Figura 3. (a) Esquema de los operones de las toxinas RTX ApxI, ApxII, ApxIII (Frey et al, 1993; Beck et al., 1994) y (b) ApxIV (adaptado de Schaller et al., 1999) en cepas de referencia de A. pleuropneumoniae. Las figuras grises representan los

extremos truncados 3’ de apxIA y 5’ de apxIIB.

2.3.5 Identificación 2.3.5.1 Bacteriológica

Se considera relativamente fácil el aislamiento del A. pleuropneumoniae a partir de lesiones neumónicas frescas (animales recientemente muertos), en contraste con las lesiones crónicas. Su detección e identificación in vitro se basa en el aislamiento bacteriano en medios sólidos tales como agar sangre o agar chocolate,

C A B D C A B D 2, 4, 6, 8 C A B D 3 C A B D 10 C A 1, 5, 9, 11 C A C A C A 7, 12 B D B D ORF1 A lacZ 1-15

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debidamente suplementados con complejos vitamínicos; y en caso de ser necesario, con algunos agentes inhibidores. Al cabo de 48 horas, las colonias son pequeñas, redondas y opacas (Holt et al., 1994). El agar sangre es utilizado para observar el fenómeno del satelitismo en dirección perpendicular a la estría nodriza de alguna colonia hemolítica; generalmente S. aureus. La caracterización del agente se realiza mediante reacciones bioquímicas (Tabla 1), resaltando la presencia de fuerte reacción ureásica y capacidad hemolítica por acción sinérgica de sus toxinas con otra de

estirpe β del S. aureus conocido como efecto CAMP (Frey et al., 1994; Schaller et al.,

1999). Para el aislamiento exitoso del A. pleuropneumoniae, se deben colectar muestras que contengan lesiones compatibles con la pleuroneumonía porcina, siendo conservadas refrigeradas en vez de congeladas.

El diagnóstico bacteriológico ha sido bien complementado por el desarrollo de técnicas moleculares; de las cuales, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es la más utilizada (Apartado 2.3.5.3).

2.3.5.2 Inmunológica

Anticuerpos contra A. pleuropneumoniae pueden ser detectados en el suero sanguíneo de animales enfermos o portadores sanos a partir de la 2ª-3ª semanas post- infección (Dreyfus et al., 2004), tema que se tratará en el Apartado 2.4.5, siendo ésta, la inmunidad humoral, la necesaria frente a la agresión por el App.

2.3.5.3 Molecular

El A. pleuropneumoniae es capaz de persistir en los tejidos; particularmente en la cavidad nasal, tonsilas y pulmones, por lo que su presencia puede ser revelada por técnicas moleculares específicas. El diagnóstico por PCR ha sido más específico en comparación con las pruebas serológicas (Apartado 2.4.5) al usar secuencias génicas bien definidas, propiciadas por los avances en la genética molecular del App.

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Tipo I

Tipo II

Tipo III

Figura 4. Diagrama de la organización genética de la región de ADN involucrada en la biosíntesis de CPS en diferentes serotipos del A. pleuropneumoniae. Las flechas indican la localización y dirección de transcripción de los genes cps. Las flechas azules y verdes representan marcos de lectura abiertos completos, mientras que las flechas grises representan genes incompletos (Jessing et al., 2008)

En los trabajos de Schaller et al., 2001; Xiao et al., 2006 y Serrano-Rubio et al. (2008), se desarrollaron técnicas de amplificación molecular; todas con diferentes niveles de sensibilidad, capaces de detectar la especie A. pleuropneumoniae a partir de tejidos y secreciones, pero con la limitante epidemiológica de no discriminar el

0 1 2 3 4 5 6 7 Kb Serotipo 1 Serotipo 12 Serotipo 5a Serotipo 2 Serotipo 6 Serotipo 7 Serotipo 8 cps1A cps1B cps12A cps12B cps5A cps5B cps5C cps5D cps2A cps2B cps2C cps2D cps6A cps6B cps6C cps6D cps6E cps7A cps7B cps7C cps7D cps8A cps8B cps8C cps8D

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serotipo específico de la infección. Sobre estas limitantes, varias técnicas de PCR han sido desarrolladas para identificar el serotipo específico dependiendo principalmente de la prevalencia regional y/o reacciones cruzadas inespecíficas entre algunos de ellos. En la Tabla 2 se presentan las técnicas de PCR múltiple hasta el momento desarrolladas para la identificación de serotipo, resaltando la ausencia de una prueba específica para los serotipos 1, 5 y 7, motivo de estudio en este trabajo.

2.4 PLEURONEUMONÍA PORCINA

2.4.1 Definición e importancia

La pleuroneumonía es la inflamación de los pulmones y de la membrana que los recubre. En el ganado porcino, es causada por el A. pleuropneumoniae, siendo una enfermedad que ocasiona considerables pérdidas económicas debido a la mortalidad generada, retardo en el crecimiento, pobre valor de la canal al momento del beneficio y costos por tratamientos y asistencia veterinaria. Además, es una de las infecciones de mayor impacto asociadas al CRP (Apartado 2.2).

2.4.2 Epidemiología

La pleuroneumonía porcina es una enfermedad ligada a la producción intensiva, siendo el cerdo el único hospedador natural del A. pleuropneumoniae, aunque experimentalmente, cobayos, ratas y ratones han representado buenos modelos para la forma aguda de la enfermedad (cita de Rodríguez y col, 2002). La enfermedad afecta a animales de cualquier edad y se encuentra distribuida en el ámbito mundial con la presencia de uno o más serotipos en una misma granja o un mismo país. En la Tabla 3 se muestra el predominio de serotipos del App en varios países, aunque esto no descarta la presencia de algún otro, además de los predominantes.

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Tabla2. Técnicas de PCR múltiple desarrolladas para el diagnóstico del A. pleuropneumoniae.

Serotipos Blanco Productos (pb) Muestra Fuente

5 Región _Región cps 1114 _{hisopado nasal.} Pulmón e Lo _1998. et al.,

cpx 715

2, 5 y 6

Región omlA 950

Cultivo puro.d Jessing et al., 2003. Región cps 500 (App 2) 1114a _{(App 5)} 720 (App 6) 1, 2 y 8 Región cpx 489

Cultivo puro. Schuchert et

al., 2004. Región cps 1603 (App 1) 1725 (App 2) 977 (App 8) 1-15b _Región apx 723, 811, 965, 2400 (App 1) Cultivo puro e hisopado pulmonar. Rayamajhi et al., 2005. 811, 965, 396, 2800 (App 2) 965, 396, 2400 (App 3) 811, 965, 396, 1600 (App 4) 723, 811, 965, 2800 (App 5a) 723, 811, 965, 2800 (App 5b) 811, 965, 396, 2000 (App 6) 811, 965, 2800 (App 7) 811, 965, 396, 2800 (App 8) 723, 811, 965, 1600 (App 9) 723, 811, 2800 (App 10) 723, 811, 965, 1600 (App 11) 811, 965, 2400 (App 12) 811, 965, 2400 (App 13) 723, 811, 2400 (App 14) 811, 965, 396, 2800 (App 15) 1-10 Región apxIVA 346 Cultivo puro, mixto, pulmón e hisopados nasal y tonsilar. Xiao et al., 2006. Región omlA 950c 1, 7 y 12 Región omlA 950c

Cultivo puro. Angen _2008. et al., Región cps 754 (App 1) 396 (App 7) 559 (App 12) 3, 6 y 8 Región apxIVA 417 e

Cultivo puro. Zhou _2008a. et al., Región cps 921 (App 3) 718 (App 6) 1106 (App 8) a _{Se utilizaron los} primers de Lo et al., 1998.

b _{Los serotipos de las casillas sin color poseen un patrón único de amplificación. Los serotipos de las}

casillas con color, comparten el patrón de amplificación. Al igual que en el trabajo de Sthitmatee et

al., 2003; quienes no usaron cepas de referencia de los serotipos 13, 14 y 15, no se pudieron

distinguir los serotipos 2-8, 5a-5b y 9-11.

c _{Se utilizaron los}

primers de Jessing et al., 2003.

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La transmisión de la pleuroneumonía porcina (A. pleuropneumoniae) se realiza principalmente vía horizontal por contacto directo entre animales infectados y susceptibles (Velthius et al., 2003). Se difunde rápidamente por aerosoles vía aérea en cortas distancias, llegando a las piaras a través de la introducción de portadores infectados (Apartado 2.4.3). Otros factores como el hacinamiento, las condiciones de manejo y el transporte (ventilación, humedad, higiene, cambios bruscos de temperatura o de alimentación), repercuten directamente como factores estresantes facilitando la diseminación del patógeno.

2.4.3 Patogenia

La patogenia de la pleuroneumonía porcina solo se conoce parcialmente e implica la participación de varias estructuras y productos del A. pleuropneumoniae, así como otros propios del hospedador.

El App penetra en el cerdo por inhalación y coloniza las tonsilas y los pulmones a nivel de bronquiolos terminales y alvéolos. En general, para la colonización bacteriana se ha demostrado que el A. pleuropneumoniae es capaz de unirse a células, anillos traqueales y secreciones del tracto respiratorio (Bélanger et al., 1990; Bélanger et al., 1994; Paradis et al., 1994), así como células bucales epiteliales (Hamer-Barrera et al., 2004) y hemoglobina (Bélanger et al., 1995) de donde obtiene nutrientes a través del antígeno “O” de los LPS. En las vías respiratorias bajas, factores del hospedador; tales como ciertos factores del mucus, condicionan la adherencia del App. En los pulmones, las bacterias son fagocitadas rápidamente por los macrófagos alveolares donde comienza la secreción de exotoxinas, las cuales poseen efecto citotóxico contra ellos, siendo la ApxI y ApxIII de particular efecto tóxico contra macrófagos alveolares (Chien et al., 2009; Beck et al., 1994). Adicionalmente, los LPS activan la producción de citoquinas que contribuyen al daño tisular (Huang et al., 1999).

El patógeno es capaz de persistir en el tracto respiratorio y otros órganos durante semanas, conllevando a animales portadores clínicamente sanos,

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considerados la principal fuente de diseminación de la enfermedad y aparición de brotes (cita de Maas et al., 2006).

2.4.4 Patología

Aunque se considera que la pleuroneumonía porcina es una enfermedad limitada al tracto respiratorio del hospedador; tal y como su nombre lo sugiere, actualmente existe evidencia que indica la patogenicidad del A. pleuropneumoniae en otros órganos tales como médula ósea (Jensen et al., 1999), hígado, bazo (Ohba et al.,

2008), sistema nervioso central, riñón (Madsen et al., 2001), corazón (Buttenschøn et al., 1997) y articulaciones (Brandreth and Smith, 1987), produciendo osteomilitis, hepatitis, esplenomegalia, meningitis, nefritis, endocarditis, pericarditis fibrinosa, artritis purulenta y tenosinovitis; respectivamente.

A nivel de sistema respiratorio, la pleuroneumonía porcina se caracteriza por presentar lesiones macroscópicas que varían dependiendo de la severidad del proceso. En la forma aguda, los cerdos presentan fiebre, depresión y anorexia, con sintomatología respiratoria manifestada por tos, cianosis y respiración oral. A la necropsia, los pulmones de estos animales aparecen con áreas de consolidación delimitadas o difusas y de color rojo oscuro pudiendo abarcar los lóbulos apical, cardiaco y/o diafragmático, características de una neumonía hemorrágica necrotizante que se acompaña con pleuritis fibrinosa (cita de Coelho et alli., 2004).

Las formas sub-aguda y crónica se desarrollan generalmente a partir del proceso agudo; y en ellas, la tos intermitente, pérdida del apetito y reducción de la velocidad del crecimiento son los síntomas más frecuentes. Las lesiones macroscópicas se evidencian por áreas de consolidación pulmonar de apariencia nodular de tamaño variable. Al corte, se puede observar que dichos nódulos están compuestos por tejido necrosado. A nivel de la pleura, ésta aparece con una inflamación adhesiva local, que muchas veces puede ser la única lesión detectable.

22 2.4.5 Diagnóstico

El diagnóstico rápido y certero de la enfermedad es crucial para controlar la enfermedad.

El diagnóstico integral de la pleuroneumonía porcina se basa en la observación en campo de la sintomatología y patología clínica (Apartado 2.4.4), complementado con el aislamiento e identificación in vitro del A. pleuropneumoniae a partir de tejido con lesiones compatibles de la enfermedad (Apartado 2.3.5.1), constituyendo el diagnóstico de certeza aunque no discrimina entre serotipos, a menos que se utilicen técnicas moleculares para identificar el serotipo actuante. Sin embargo, el monitoreo serológico ha sido la metodología rutinaria para detectar la infección en granjas porcícolas, incluyendo aquellas subclínicas o asintomáticas.

Hasta ahora, varias técnicas serológicas han sido desarrolladas para detectar anticuerpos anti A. pleuropneumoniae tales como ELISA, incluyendo aquellas para detectar anticuerpos contra todos los serotipos (Wang-wang et al., 2008; Dreyfus et al., 2004), así como para serotipos específicos; individual (Klausen et al., 2007) o combinadamente (Bossé et al., 1990). Estas metodologías no son suficientes para realizar diagnósticos etiológicos en casos agudos, por lo tanto, deben utilizarse de forma combinada.

2.4.6 Tratamiento

Varios medicamentos y estrategias terapéuticas han sido utilizados para el tratamiento de la enfermedad (Fittipaldi et al., 2005; Lauritzen et al., 2005). Aunque debe destacarse los cambios en la resistencia a los antibióticos (Gutiérrez-Martín et al., 2006; Matter et al., 2007), probablemente debido al uso indiscriminado y prolongado de estos medicamentos. En contraste, en el trabajo de Ramjeet et al. (2005), se encontró que el truncamiento de residuos específicos en los lipopolisacáridos del A. pleuropneumoniae, afecta la susceptibilidad a los péptidos

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catiónicos, sugiriendo que un core externo intacto en los LPS es esencial para su protección contra estos antimicrobianos.

2.4.7 Prevención y control

Ningún antígeno individual ofrece protección completa contra los 15 serotipos del App, lo que sugiere que una eficiente protección cruzada sería conferida por vacunas compuestas de múltiples antígenos; sin embargo, la vacunación no es capaz de proteger a los animales de la colonización bacteriana (Oldfield et al., 2009). Al respecto, varios antígenos y estrategias de inmunización han sido investigados como candidatos vacunales, incluyendo toxinas Apx (Haga et al., 1997), LPS y CPS (Byrd and Kadis, 1992), proteínas de membrana externa (OMPs) (Oldfield et al., 2008), proteínas autotransportadoras (Oldfield et al., 2009), así como vacunas DNA (Chiang et al., 2009), vacunas subunitarias DIVA (Maas et al., 2006) y mutantes por deleción génica (Liu et al., 2007); que logran discriminar animales vacunados e infectados en campo, y protocolos a diferentes dosis (Bernardy et al., 2008).

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Tabla 3. Distribución de serotipos del A. pleuropneumoniae por países (Tomado y adaptado de Vanden Bergh et al., 2008).

País Serotipos Alemania 2, 7, 9 Australia 12 (41 %), 1 (30 %), 7 (24 %) Bélgica 2 (36 %), 3 (21 %), 9 (15 %), 5b (10 %) Corea 2 (56 %), 5 (28 %), 6 (11 %), 7 (2 %) Croacia 2, 9 Dinamarca 2 (84 %), 6 (11 %) España 4 (42,2 %), 7 (22,5 %), 2 (12,8 %) Estados Unidos 1, 5 Francia 9 Hungría 2, 3, 7 Irlanda 3 Japón _{7 (1,5 %), 8 (1,5 %), 3 (1,4 %), 12 (0,5 %)}2 (52,5 %), 1 (36,3 %), 5 (6,2 %), Noruega 2 Países Bajos 2, 9, 11 Polonia 1, 9 Canadá 1 (68 %), 5 (23 %), 3-6-7-8-10-12 (9 %) Reino Unido 2, 3, 8 Suecia 2 Suiza 2 República Checa 9 (46,5 %), 2 (18,5 %), 11 (14,2 %), _{4-5-7-12 (2,4 %)}

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3. OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GENERAL

Detectar e identificar simultáneamente y discriminar los serotipos 1, 5 y 7; respectivamente, de la especie A. pleuropneumoniae, mediante la amplificación concomitante de los genes apxIVA y cps por técnicas de PCR múltiple, orientadas al oportuno e integral diagnóstico de la pleuroneumonía porcina y su potencial aplicación sobre especímenes clínicos.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Aplicar herramientas computacionales a la búsqueda y análisis de secuencias nucleotídicas pertenecientes al A. pleuropneumoniae.

 Estudiar y/o diseñar primers específicos para la detección molecular de la especie A. pleuropneumoniae y primers específicos para la identificación molecular de los serotipos 1, 5 y 7, respectivamente.

 Establecer las condiciones químicas y térmicas óptimas para la amplificación simultánea de las regiones especie-específica y serotipo-específicas en el A. pleuropneumoniae.

 Evaluar la especificidad analítica in silico e in vitro de los primers utilizados para la detección e identificación de las regiones específicas de especie y serotipo, respectivamente.

 Determinar las cantidades mínimas de ADN detectables por las técnicas de PCR múltiple desarrolladas y optimizadas.

 Determinar la proporción de amplificación molecular de los genes apxIVA y cps en cepas de campo colombianas del A. pleuropneumoniae y especímenes clínicos de origen porcino.

 Determinar la proporción de aislamientos bacterianos positivos a la especie A. pleuropneumoniae a partir de especímenes clínicos de naturaleza pulmonar.

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 Comparar las técnicas de amplificación molecular múltiple; enfatizando en la región especie específica, con el método de identificación bacteriológica convencional, a partir de cepas de referencia y cepas de campo colombianas.

 Realizar un estimado comparativo entre las técnicas de amplificación molecular y el método de aislamiento bacteriano a partir de especímenes pulmonares con lesiones aparentes de pleuroneumonía porcina.

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4. MATERIALES Y MÉTODOS

4.1 EQUIPOS

Todos los equipos utilizados en este estudio hacen parte de los laboratorios de microbiología y biología molecular. De propiedad del Instituto Colombiano Agropecuario (ICA) y ubicados en el Laboratorio Nacional de Diagnóstico Veterinario (LNDV), sus características y detalles se mencionan a continuación:

a. Incubadora 37°C Model 320 (NAPCO. Portland USA).

b. Plancha de calentamiento Model 2050 (BL. Melrose Park, USA).

c. Microcentrífuga refrigerada Model 5417R (EPPENDORF. Netheler, GER).

d. Espectrofotómetro Nanodrop 1000 (THERMO SCIENTIFIC. Waltham, USA).

e. Ultracongelador -70°C Ultima II (REVCO. Asheville, USA).

f. Cabina de seguridad clase II PurifierTM (LABCONCO. Kansas, USA).

g. Cabina de flujo laminar vertical PCR Cabinet (ESCO. Changi, SIN).

h. Termociclador DNA Engine Dyad (BIO-RAD. Hercules, USA).

i. Fuente de poder Powerpack 3000 (BIO-RAD. Hercules, USA).

j. Cámara de electroforesis (BIO-RAD. Hercules, USA).

k. Fotodocumentador GelDocTM XR (BIO-RAD. Segrate, ITA).