Organización y plegamiento general

La estructura de CbpF está plegada en dos módulos bien definidos (Figura 3.6.11): el módulo N- terminal (residuos 1-128), que presenta una conformación en forma de disco (37 x 34 x 24 Å), y el módulo de unión a colina (residuos 129-311) organizado a su vez en dos dominios denominados CI y CII (Figura 3.6.11) que presentaban el plegamiento superhelicoidal encontrado previamente en otras CBPs. El dominio CII (residuos 193-311) contiene cinco

repeticiones de unión a colina (p1-p5), con el motivo consenso (GWXK-X4-5-WYY-hidrofóbico-X3-

5-GXMX2-3), y un extremo C-terminal de 16 aminoácidos (295-311) que presenta el mismo

plegamiento superhelicoidal que el resto del CBM. Cada repetición está compuesta por una horquilla β simétrica seguida de un lazo y una región sin estructura secundaria regular, y están estrictamente dispuestas siguiendo un plegamiento superhelicoidal a izquierdas, similar al observado en C-LytA (Fernández-Tornero et al., 2001), el dominio CI de Cpl-1 (Hermoso et al., 2003) y el módulo de anclaje de Pce (Hermoso et al., 2005). Las horquillas se extienden perpendicularmente al eje de la superhélice y cada repetición está localizada a 120º en sentido antihorario. El dominio estructural CI (residuos 129-192) presenta dos repeticiones modificadas (dp5 y dp6), mostrando inserciones/adiciones de aminoácidos dentro de la horquilla β de la

repetición dp6 y también en el bucle posterior a la horquilla β de la repetición dp5 (representadas en rojo y azul en la figura 3.6.12a). Este dominio CI define una región de conexión entre el modulo N-terminal y el CBM. El dominio de unión a colina puede ser descrito a grandes rasgos como un prisma triangular de unos 76 Å de altura con caras de 26 Å, con los sitios de unión a colina situados a lo largo de las tres caras laterales.

CbpF presenta una característica única con respecto a otros miembros de las proteínas de unión a colina: la secuencia de CbpF está constituida enteramente por repeticiones de unión a

Figura 3.6.11: Estructura tridimensional de CbpF en complejo con colina. La estructura de CbpF aparece

coloreada en función de las regiones estructurales diferenciadas: en verde, región N-terminal; en azul, región interdominio; en naranja, región C-terminal. Las moléculas de colina unidas a los sitios de unión a colina están representadas por esferas.

Figura 3.6.12: Análisis secuencial y estructural de CbpF (a). Comparación de la secuencia aminoacídica de los

sitios de unión a colina. Las repeticiones canónicas son representadas con la letra p y las repeticiones modificadas como dp. Los aminoácidos implicados en hebras beta aparecen resaltados en negrita. (b) Representación estereográfica de la superposición de carbonos α de todas las repeticiones de unión a colina. En verde, se representan las repeticiones canónicas de unión a colina p1, p2, p3, p4, p5 así como las repeticiones modificadas dp1 y dp2. En naranja se representa dp3, en gris dp4, en azul claro dp6, y en rojo dp5. El intervalo de valores de la desviación cuadrática media (r.m.s.d) de las repeticiones p1 a p5 va de 0.30 a 0.70Å; mayor diferencia se observa entre las repeticiones canónicas y repeticiones modificadas (los valores r.m.s.d oscilan entre 0.44 y 1.02

(a)

(b) (a)

colina, unas de ellas siguiendo estrictamente el motivo consenso (región CII, repeticiones p1- p5), otras aparecen como repeticiones parcialmente modificadas por inserciones de aminoácidos (región CI, dp5-dp6) y otras altamente modificadas, tanto por inserciones de aminoácidos como por mutaciones sobre diferentes posiciones del motivo consenso (módulo N- terminal, dp1-dp4) (Figura 3.6.12a). La presencia de este esquema de repeticiones de unión a colina a lo largo de toda la secuencia primaria produce la forma alargada de la estructura de CbpF (más de 117 Å de longitud) de tal modo que las repeticiones canónicas y modificadas son perfectamente superponibles entre sí (Figura 3.6.12b).

La estructura cristalina de CbpF en complejo con colina muestra que hasta siete sitios están disponibles (Figura 3.6.11). Estas siete moléculas de colina están todas localizadas en el CBM en sitios de unión a colina canónicos de tal modo que, al menos, tres residuos aromáticos estructuralmente conservados (dos Trp y una Tyr) más un residuo hidrofóbico (Met o Leu) forman una cavidad en la que se sitúa el grupo metilo de la colina (Figura 3.6.13). Este patrón para los sitios de unión se observa tanto en el dominio CI como en el CII, mientras que en el módulo N-terminal, constituido por cuatro repeticiones de unión a colina altamente modificadas (dp1-dp4), no se cumplen los requerimientos para la unión de colina (como prueba la ausencia de dicha molécula en el N-terminal de CbpF). En las repeticiones dp1, dp2 y dp4 al menos uno de los residuos críticos de Trp es reemplazado por Thr o Lys (Figura 3.6.12a) de modo que se produce una reducción en la capacidad de unión a colina y, además en el caso de las mutaciones por Lys posibilitan la formación de interacciones por puente salino críticas en la disposición modular de CbpF. Particularmente interesante resulta el potencial sitio de unión a colina formado entre las repeticiones dp3 y dp4 que presenta a priori todos los aminoácidos necesarios, pero que no une colina (Figura 3.6.14) debido a la presencia de un residuo de Lys (Lys 96) en el interior de la cavidad. Por otro lado existe un sitio de unión a colina funcional formado por las repeticiones dp5 y dp6 del dominio CI que están modificadas respecto a las repeticiones canónicas. Las repeticiones dp5 y dp6 tienen inserciones de 13 residuos cada una y, a pesar de esta gran alteración, los aminoácidos que participan en el reconocimiento de colina (Trp130, Trp137, Tyr182 y Met190) están conservados, cumpliéndose de este modo los requisitos básicos para la unión.

Figura 3.6.13: Representación estereográfica de la molécula de unión a colina unida al sitio de unión a colina,

Repeticiones de unión a colina en el módulo N-terminal

Repeticiones de unión a colina en el CBM