33 Desarrollo folicular
Se analizó si el tamaño (en mm) de los folículos preovulatorios varió según la hora post-eCG.
El diámetro folicular (mm) fue afectado por las horas post-eCG (P=0.0002), aumentando a las 28 horas, alcanzando el máximo a las 36 horas y disminuyendo a las 42 horas (Tabla 1).
Diámetro de los folículos preovulatorios (mm) según la hora post-eCG
Horas post-eCG Media E.S.M
12 (n=40)
4.6571
0.4157
a
20 (n=40)
5.3364
0.3316
a
28 (n=40)
6.9077
0.3051
b
36 (n=40)
7.2667
0.4490
b
42 (n=6)
5.8000
1.0999
a
Tabla 1. – Diámetro de los folículos preovulatorios (mm) de ovejas sincronizadas con esponjas intravaginales impregnadas con 60mg de MAP por 13 días, según las horas post administración de eCG (n=40). Diferentes letras indican diferencias significativas (P< 0.0002).
34
Intensidad de pixeles de los folículos preovulatorios
Se encontró una correlación positiva entre el diámetro folicular (mm) y la intensidad en pixeles del líquido folicular de los folículos preovulatorios (r=0.3292, n=39, P<0.04) (Figura 2).
Correlación entre la intensidad de pixeles del líquido folicular y el diámetro de los folículos preovulatorios
Figura 2. - Correlación entre la intensidad de pixeles del líquido folicular y el diámetro de los folículos preovulatorios en ovejas sincronizadas con esponjas intravaginales impregnadas con 60mg de MAP por 13 días y la administración de 300 UI de eCG intramuscular. Se encontró una correlación positiva, r=0.3292, n=39, (P<0.04).
0 10 20 30 40 50 60 70 80 2 3 4 5 6 7 8 9 10 In ten sid ad en p ixe le s d e lo s folicu los .
35 Diámetro de cuerpos lúteos incipientes
Algunos de los CL fueron vistos por primera vez antes de las 42 horas post-eCG y otros después. Se analizó si los CL que fueron vistos por primera vez antes del tratamiento tenían distinto diámetro de los que fueron vistos después.
El tamaño del CL no fue diferente antes o después de la aplicación de los tratamientos (P= 0.3119) y tampoco fue diferente entre grupos (Cb vs Cb+Dp) cuando el CL fue visualizado luego de las 42 horas post- eCG (P= 0.7448). (Figura 3)
Diámetro (mm) de los cuerpos lúteos incipientes desarrollados antes o después de los tratamientos para inducir la dilatación cervical
Figura 3. – Diámetro (mm) de los cuerpos lúteos incipientes de ovejas sincronizadas con esponjas intravaginales impregnadas con 60mg de MAP por 13 días y administración de 300 UI de eCG intramuscular y tratadas a las 42 h post-eCG para inducir la dilatación cervical con Cb y Dp (grupos Cb y Cb+Dp). No hubo diferencias significativas (P= 0.7448). 7,27 8,05 7,25 5 6 7 8 9 Diamet ro ( mm ) CL
Diametro (mm ) CL incipiente desarrollado antes o después del tratamiento para inducir la dilatación cervical
Antes Después (Cb) Después (Cb+Dp)
36 DISCUSIÓN
Momento de la ovulación
La constatación de que 34 de los 40 animales (85%) ovularon antes de las 42 horas post-eCG fue sorpresiva, dado que el diseño experimental preveía que las ovulaciones se concentraran alrededor de las 60 horas post-eCG, es decir, posterior a las 54 horas -momento previsto para la realización de una IATF- luego de la sincronización con MAP y eCG (Gordon 1996; Olivera-Muzante y col. 2011; Abecia y col. 2012; Dos Santos Neto y col. 2015).
Utilizando ultrasonografía ovárica, Ali y colaboradores (2009), reportaron que ovejas Farafra sincronizadas con un dispositivo intravaginal de silicona impregnado con progesterona natural por 12 días y al retiro 400 UI de eCG, comenzaron a ovular a las 48 horas post- eCG y la misma se extendió hasta las 72 horas. Similarmente, en ovejas Corriedale sincronizadas con un dispositivo intravaginal también con P4 natural pero por 6 días y a su retiro 300 UI de eCG, la ovulación ocurrió entre las 62 y 74 horas post-eCG (Vilariño y col. 2010, 2013). Por el contrario, y coincidiendo con nuestro trabajo, cuando se sincronizaron ovejas Polwarth (Ideal) con un dispositivo intravaginal con MAP por 12 días y 250 UI de eCG al retirarlo, las ovulaciones ocurrieron antes de las 48 hs post-eCG (Viñoles y col. 2001). Considerando que la potencia biológica de la MAP es mayor que la de la P4 natural y su vida media más larga (Africandera y col. 2014), cabe plantearse la hipótesis de que la MAP ejerza un efecto inductor del recambio folicular (Rubianes y col. 1999; Viñoles y col. 2001) mayor respecto a la P4 natural y que esto pueda favorecer el rápido surgimiento de la onda folicular ovulatoria al retirar la esponja y administrar eCG y determinar una ovulación más temprana. Los reportes de intervalo eCG-ovulación mayores cuando se utilizan tratamientos cortos de MAP con respecto a los tratamientos largos van en el mismo sentido (Viñoles y col. 2001).
Por otro lado, las 6 ovejas que ovularon después de las 42 horas post-eCG fueron tratadas con Cb, lo que sugiere que esta hormona podría estar involucrada en el retraso de la ovulación de los folículos ovulatorios. Interesantemente, Bobowiec y colaboradores, (2003) obtuvieron una disminución de las concentraciones circulantes de E2 en respuesta a la administración de Ox natural en ovejas sincronizadas con P4.
37
Esta acción directa de la Ox sobre la disminución de la esteroidogénesis folicular, podría estar relacionada al retraso de la ovulación en este experimento. Por otro lado, la Ox está asociada a la liberación de GnRH como factor hipotalámico pre ovulatorio, estimulando entonces a la liberación de FSH y LH en la hipófisis anterior (Bobowiec, y col., 2003), por lo cual, una acción de la Ox sobre el eje hipotálamo-hipofisiario, podría comprometer el proceso de dominancia folicular lo que a su vez permite el crecimiento de nuevos folículos (Wathes y col, 1989; Bobowiec y col, 1999). En ése sentido, la administración de Ox natural, en solución acuosa o en una preparación oleosa de liberación lenta, aumentó la tasa ovulatoria en ovejas (King y Coetzer, 1996, 1997).
Desarrollo folicular
Debido al bajo número de ovejas que ovularon luego de la administración de los tratamientos de inducción a la dilatación cervical, no se pudo analizar el efecto de cada tratamiento sobre el diámetro folicular.
Se observó que el desarrollo folicular en términos de diámetro aumentó a las 28 horas post eCG y llegó al máximo a las 36 horas post-eCG, en acuerdo con la ocurrencia de las ovulaciones previas a las 42 horas post-eCG de la mayoría de las ovejas y al efecto estimulante del crecimiento folicular provocado por la eCG (Evans y Robinson 1980; Viñoles y col. 2001).
Intensidad de pixeles de los folículos preovulatorios
Se ha planteado la existencia de una correlación entre la intensidad de pixeles del líquido folicular y el estado funcional de los folículos, en términos de producción de estradiol (Singh y col., 1998; Singh y Adams, 2000). Esto podría deberse a que durante la fase final de crecimiento del folículo antral, los mismos se vuelven deficientes en células de la granulosa, y el contenido de las mismas se empieza a desprender de la pared y queda disperso en el fluido folicular (Espey, 1999; Singh y Adams, 2000). La correlación positiva entre el diámetro folicular y la intensidad de pixeles previo a la ovulación, reflejaría el grado de desarrollo que los folículos ovulatorios alcanzaron momentos antes de la ovulación.
38 Diámetro de cuerpos lúteos incipientes
En el presente trabajo no se encontraron diferencias significativas en el diámetro de los CL incipientes observados antes o después de los tratamientos de inducción a la dilatación cervical. Tampoco entre los distintos tratamientos en aquellos CL formados luego de las 42 horas post eCG (Cb vs. CbDp).
No se puede descartar que eventuales diferencias en el diámetro de los CL a consecuencia de los tratamientos se manifiesten en la medida que éstos se desarrollen más allá del estadio incipiente. En ese sentido, se ha visto que el área total y el área de vascularización del CL aumentaron días después de la ovulación, en correlación positiva con la producción de progesterona durante la luteogénesis (Arashiro y Brandao 2008; Siqueira y col 2009; Figueira y col. 2015), por lo que sería de gran importancia el seguimiento del CL más allá de su estado incipiente.
39 CONCLUSIÓN
La hipótesis planteada en este trabajo no pudo ser verificada en el ensayo experimental.
En ovejas Corriedale, sincronizadas con protocolo MAP-eCG durante la estación reproductiva, se observó que el momento de ovulación se adelantó con respecto a lo esperado, habiendo ovulado todas las ovejas antes de las 54 horas post-eCG, momento en el que iban a ser inseminadas. A su vez, el 85% de los animales ovuló antes de las 42 horas post-eCG, por lo tanto no fueron influidos por el tratamiento de inducción a la dilatación cervical. Los 6 animales restantes que ovularon luego del tratamiento fueron administrados con Cb, lo que sugiere que la Cb podría retrasar el momento de la ovulación.
En cuanto al diámetro folicular, debido a que la mayoría de los animales ovularon antes de la aplicación de los tratamientos, no se pudo evaluar si éstos afectan el desarrollo del folículo. Como alternativa, se determinó el crecimiento del folículo según las horas post-eCG, observándose un aumento del diámetro hasta un máximo a las 36 horas post-eCG, coincidiendo con el momento de la ovulación de la mayoría de los animales. Por otro lado se halló una correlación positiva entre el diámetro y la intensidad de pixeles de los folículos preovulatorios.
Con respecto a los CL recién formados, no se vio ninguna diferencia significativa entre los observados antes y después de los tratamientos, ni entre los distintos grupos de tratamientos.
40 RECOMENDACIONES
En primer lugar, por el motivo de que el 85% de los animales ovularon antes de las 42 horas post-eCG, por lo tanto, antes del momento en que se realizaría la IATF (Gordon, 1996; Olivera-Muzante y col., 2011; Abecia y col., 2012; Dos Santos Neto y col., 2015), implica que las ovejas serían inseminadas después de la ovulación. La vida fecundable de los ovocitos ovinos se ha estimado en 12 - 24 horas (Dzuik, 1965) y el tiempo estimado de migración de los espermatozoides desde la vagina hasta el oviducto es de 8-10 horas (Druart y col., 2009). Entonces se debería adelantar la hora de inseminación, quedando anterior a la ovulación de la mayoría de las ovejas y de esta forma no comprometer la fertilidad.
Una vez corregida la hora de IATF, ajustar las horas de los tratamientos con Cb y Dp, siendo la administración de las hormonas 12 horas antes de la IATF debido a su acción biológica y vida media en sangre.
Por otro lado se ha visto que la utilización de la dosis de 300 UI de eCG no ha presentado ovulaciones múltiples en las ovejas sincronizadas con esta hormona, por lo tanto promete ser una dosis apta y recomendable para la sincronización de la ovulación de las ovejas en los programas de IATF.
Otra recomendación en cuanto a este experimento, sería la de implementar una sincronización con MAP durante un período más corto. Por ejemplo, 6 días ya que se ha comprobado sus ventajas post inseminación, aumentando los porcentajes de preñez. La tasa de preñez en ovejas sincronizadas con dispositivo intravaginal de P4 durante un corto plazo (6 días) es mayor comparada con la aplicación a largo plazo (12 días), con resultados de 83% y 63%, respectivamente. La menor tasa de preñez observada después del tratamiento a largo plazo con progestágeno está relacionada con un recambio folicular más lento, que estimuló la ovulación de los folículos persistentes dominantes, a diferencia del tratamiento a corto plazo que resultó en una tasa de preñez más alta, probablemente, debido a la ovulación de folículos en crecimiento recién reclutados (Viñoles y col., 2003).
A su vez, comparando los tratamientos con MAP de 6, 9, y 13 días, se observó una tasa de concepción mayor en los animales tratados durante 9 días, con resultados de 75% vs 66,7% para 6 días y 63% para 13 días. (Ungerfeld y Rubianes, 1999).
41
Se recomendaría también en caso de realizar nuevamente este protocolo, el seguimiento ecográfico luego de la ovulación, para evidenciar el estado y tiempo de vida del CL resultante, más allá de su estado incipiente, -podría complementarse con análisis de P4 sérica- para comprobar la viabilidad de ese CL y que el tratamiento de inducción a la dilatación cervical tanto con Cb como con Dp no interfieren en el desarrollo normal del mismo, esperando buena viabilidad embrionaria y mantenimiento de la preñez.
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