P OSADA EN MARXA DEL CULTIU

El protocol a seguir per portar a terme tant el cultiu discontinu com el semicontinu (“fed-batch”) són idèntics en la seva fase inicial d’arrencada. L’únic que els diferencia és la utilització de diferent composició del medi inicial, amb les petites modificacions del protocol que això pot comportar.

Abans de procedir a l’esterilització del reactor cal que els següents complements del fermentador siguin esterilitzats per separat a l’autoclau :

Punxó de 3 vies (per a l’addició de base, l’inòcul i l’antiescumejant) (almenys dues de les vies han d’estar preparades pel funcionament amb les bombes peristàltiques del Biostat ED). Tots els tubs han d’estar tancats amb claus Hoffman i embolicats amb paper d’alumini. A l’extrem dels tubs cal muntar les agulles metàl·liques.

Punxó de 1 via (per a l’addició de glicerol). El tub tancat amb Hoffman i embolicat amb paper d’Alumini. El punxó es tapa amb la caputxa metàl·lica.

Punxó de 1 via (per l’addició de metanol). El tub tancat amb Hoffman i embolicat amb paper d’Alumini.

Els punxons es tapen amb la corresponent caputxa metàl·lica per mantenir la seva esterilitat fora de l’autoclau.

1 ampolla amb sèptum de 1 litre d’aigua destil·lada per ajustar el volum a 3.5 L desprès d’inocular.

1 ampolla amb sèptum de 500 ml amb 300 ml d’aigua destil·lada (per al inòcul).

1 ampolla amb sèptum d’antiescumejant Structol J673 1000X.

1 ampolla amb sèptum de 500 ml de HCL 1 M (per a l’esterilització química de la microbureta).

1 ampolla amb sèptum de 500 ml de NaOH 1 M (Esterilització química de la microbureta).

1 ampolla amb sèptum de 500 ml de H2O (Esterilització química de la

microbureta).

1 ampolla amb sèptum de 500 ml buida (per recollir el líquid sobrant de l’esterilització química de les microburetes).

2 pots de 250 ml de la Centrífuga KONTRON. Cal esterilitzar-los lleugerament oberts i tapats amb paper d’Alumini.

La “T” de la sortida de gasos. Totes les sortides cal que estiguin embolicades amb paper d’Alumini.

1 ampolla amb sèptum de 250 ml de glicerol 50 % (v/v).

Cal posar-ho tot a una cistella metàl·lica i esterilitzar-ho a 121 ºC durant 30 min.

A part, però sense passar per l’autoclau es preparen les següents ampolles: 1 ampolla amb sèptum de 500 ml d’Etanol al 70 %

1 ampolla amb sèptum de 1 L de Metanol pur.

Segons la solució de base utilitzada, en funció del medi utilitzat, cal esterilitzar-la o no. Per exemple, en el cas de la solució d’amoni al 30% no es pot autoclavar i es pot utilitzar directament a la fermentació.

A continuació es procedeix al muntatge del reactor amb independència del medi de cultiu utilitzat (BMDY, BCM, MFBD_1 o MFBD_2). És important que en el procés de preparació en qualsevol dels medis utilitzats, el glicerol sigui l’últim component addicionat, ja que s’ha comprovat que això millora la solubilitat de les salts inorgàniques.

Preparació del reactor

Neteja: Cal netejar amb aigua destil·lada l’interior del reactor i intentar treure tots els precipitats que puguin haver quedat adherits a les parets de les pales i del serpentí. No s’ha d’utilitzar ni sabó ni lleixiu, o en el cas que s’utilitzin, s’han de passar grans quantitats d’aigua destil·lada per tal d’evitar que quedin restes d’aquests components.

Instal·lació de les sondes:

o Sonda de pH: Abans de col·locar la sonda dins el reactor cal calibrar-la amb tampó pH 7.00 i pH 4.00 (Panreac, Castellar del Vallès, Espanya). Per aquest fi, s’utilitza el menú de la Digital Control Unit-.DCU (Calibration" pH).

o Sonda pO2 (Oxigen dissolt): El calibratge d’aquesta sonda es realitza després de l’esterilització. El que s’ha de fer abans d’esterilitzar és el canvi d’electròlit i substituir la membrana en el cas que es vegi deformada. S’han de comprovar que en connectar la sonda la mesura va baixant progressivament fins arribar a un valor aproximat del 70–80 %. Si no és així, s’ha de substituir l’electròlit i la membrana.

Muntatge del fermentador:

Per dur a terme el muntatge i la preparació del fermentador cal:

Assegurar-se que la junta de la tapa del reactor està en bon estat i untada de silicona.

Addicionar el medi inicial i enrasar a 3.5 L amb aigua destil·lada. Col·locar la tapa i collar les rosques en forma d’estrella.

MATERIALS I MÈTODES Col·locar el manòmetre, la vàlvula de seguretat, l’entrada d’aire amb el filtre i el condensador més el portafiltres amb el filtre al seu interior. Assegurar-se que l’aire entra per capçalera del reactor i no s’introdueix pel difusor situat a la part inferior.

Assegurar-se que no circuli aigua pel condensador. (L’aixeta ha d’estar ben tancada).

A la resta d’entrades del fermentador col·locar-hi un sèptum amb el seu corresponent tap.

Desconnectar la sortida de gasos del fermentador que es dirigeix a l’equip de pressió i a l’analitzador.

Esterilització:

Abans d’esterilitzar es col·loca la camisa metàl·lica protectora al voltant del cilindre de vidre del reactor, com a mesura de seguretat.

Cal assegurar-se que totes les entrades/sortides del reactor estan ben tancades.

S’ha d’arrencar el programa automàtic d’esterilització de la DCU (Batch Process " F1 (Esterilitzation) " Start). El procés mantindrà el reactor durant 30 minuts a 121 ºC.

Connexió de l’equip de gasos: Connectar l’equip de gasos, perquè s’escalfi progressivament i estigui operatiu quan es comenci la fermentació .

IMPORTANT: El tub dels gasos de sortida del fermentador ha d’estar desconnectat del control de pressió i de l’equip d’anàlisi de gasos durant el procés d’esterilització.

Finalment es deixa refredar el reactor durant unes dues hores fins que estigui a temperatura ambient.

3.5.4. P

M