P RODUCCI ÓN DE E TANOL

A pa rtir de la ecua ción que se de term inó del set de calibración se puede predecir la concentra ción que se encue ntra en las muestras fermentada s. Para ello se centrifuga ron nuevamente a 4˚C y 4000 rpm durante 25min con el fin de reducir la cantidad de bioma sa en el so brenadante y e vitar una m ayo r interfere ncia en lo s e spectro s al momento de hacer la s mediciones. En la figura 3 2 se pueden obse rva r lo s un ejem plo de los especto rs obtenidos para la s m uestra s. Como blanco se utilizó m edio de cultivo fermentado por la cepa Escherichia coli W3110/ pCA24N adhE a las m ism as concentracione s de glicerol utilizadas en las mue stra s.

Figura 32. Espectro para una de las muestras en el NIR.

La s concentracione s d e etanol predichas po r la e cuación de calibración se m ue stran en la s tabla s 5 y 6. Com o se pue de observa r ha y una relación dire cta e ntre la concentra ción de glicerol y la concentración de eta nol, a mayor cantidad de su strato se produjo una mayor cantidad de eta nol. Sin embargo, la s de sviacione s estándar para

e sto se debe a que para alguna s de las replica s el NIR no dete ctó un cam bio significativo con el blanco en la longitud de onda establecida y por lo tanto la cantidad predicha de etanol fue de 0g/L . Esto se pu ede deber a que el blanco utilizado fue fermentado con una ce pa diferente (del m ism o tipo que el utilizado para la elabora ción de la curva de calibración) y puede tene r diferente s con centracione s de otro s produ cto s que también tienen el enlace -OH. Otra posibilidad e s que al evapora r la s m uestra s que confo rmaron la curva de calibración y validación, lo cual se realizó a 45˚C du rante 4 0min, no se halla eliminado en su totalidad el etanol produ cido, po r lo que la base con la que se calculó la ecuación de calibra ción no sería la correcta y se e starían p rediciendo valore s menores a lo s reale s.

Tab la 5. Producción de etanol para la cepa Escherichia coli W 3110/ pCA24N pflB.

Muestras [Glic erol] (g/ L) [Eta nol ] (g/ L) Re plica 1 10 0,077825 15 1,18236 20 No detectó Re plica 2 10 0,43212 15 No detectó 20 0,12256 Re plica 3 10 0,1914 15 No detectó 20 0,16318 Re plica 4 10 0,28284 15 No detectó 20 0,9771

Tab la 6. Concentraciones promedio de etanol para la cepa Escherichia coli W3110/ pCA24N pflB (4 réplicas). [Glic erol] (g/ L) [E tanol] (g/ L) Desv iación está ndar 10 0,2460 0,150 15 0,2956 0,591

20 0,3157 0,446

En la figura 33 se m uestran lo s re sultado s mencionados anteriormente pa ra cada una de las concentracione s de glicerol. Los nivele s obtenido s de eta nol produ cido se encuentran por d ebajo de los 2g/l. Una de la s po sibles razone s po r la s cuale s no se produjo m ás etanol, es que los niveles de o xigeno en los tubo s no hallan permitido una buena fermentación del m icroorgani smo. Por otra pa rte, com o el NIR no mide la concentra ción de pro ducto en particula r, sino que detecta la longitud de onda a la cual la absorbancia sea má s sen sible para cierto tipo de enlaces en dicho produ cto; puede suceder que tan to los productos se cundario s com o el m ism o su strato afe cten la s m ediciones en la a b so rban cia caracteristica de lo s enlaces -OH. Tam bién es po sible que la utilización de glicerol halla sido muy baja, para determ inar el rendimiento real de etanol se hace nece sario m edir la concentración final de glicerol en el m edio.

Anteriorm ente se concluyó que diferentes co ncentra ciones de glicerol no afectaban el valor de etanol obtenido por la curva de calibración, sin em bargo los nivele s de produ cto s secundarios com o el succianato, el formato, el acetato, entre otros, pueden e star afectando negativamente la m edición.

F ig ura 33. Concentración de etanol para cada concentración de glicerol obtenida con la cepa Escherichia

coli W 3110/ pCA24N pflB (4 réplicas).

concentra ción de sustrato utilizado. Por su parte, en la tabla 8 se repo rtan la s concentra ciones promedio, en donde se puede obse rva r que al igual que con la cepa que sobre expre sa pflB, hay una relación dire cta, a m ayo r concentra ción de glicerol se obtuvo un a m ayor concentración de etanol. También se puede a pre ciar qu e lo s nivele s alcanzado s son menore s a los que se obtu vieron con la cepa mutada.

Tabla 7. Producción de etanol para la cepa salvaje

[Glicerol] (g/L) [Eta nol ] (g/ L) Muestra Silv estre 10 0,09478 15 0,14762 20 0,06528 Re plica Silv estre 10 0,02972 15 0,05764 20 0,22612

Tabla 8. Concentraciones promedio de etanol para la cepa salvaje (2 réplicas).

[Glic erol] (g/ L) [E tanol ] (g/ L) Desv iación está ndar 10 0,0623 0,046 15 0,1026 0,064 20 0,1457 0,114  

F igura 34. Concentración de etanol para cada concentración de glicerol obtenida con la cepa salvaje (2

réplicas).

En la s figura s 34 y 35 se repo rtan las gráfica s d e los resultados que se vieron anteriorm ente. De e sta form a, se p uede concluir qu e la sob re e xpresión del gen pflB en Esche richia coli permite aum entar la produ cción de etanol en la fermenta ción anaeróbica de glicerol. De hech o, el aumento es de casi 4 vece s con 10g/L de glice rol, tal como se puede ver en la tabla 9. De la misma forma, el menor aum ento se reporto con 20g/L de glicerol, e n don de el aumento fue del 100%. Es importante mencionar que el pe riodo de fe rm entación pa ra las mue stra s con la cepa silvestre fue un p oco m enor, sin embargo la variación no e s lo suficientem ente grande com o para justificar el aumento de etanol que se dio.

F igura 35. Comparación entre las concentraciones de etanol para la cepa silv estre y la cepa Escherichia

coli W 3110/ pCA24N pflB.  

Tab la 9. Aumento en la producción de etanol al sobre expresar el gen pflB.

[Glicerol] (g/L)

[Eta nol ](pfl B)/[Eta nol ](Silvestre )

10 3,9526

15 2,8802

20 2,1668

Por últim o, com o se mencionó al principio del proyecto, se realizó la predicción de las concentra ciones de etanol con u na seg unda curva de calibración teniendo en cuenta el rango en donde se en cuentran lo s re sultado s. Con esto se quiere tener una m ayor preci sión de los valore s reportado s. La e cua ción de la nueva curva de calibración se cita a continuación.

(2) 0.0043 1437,6002

Como se puede ver, la longitud de onda que tom ó el equipo es la misma que para la primera ecu ación, d e a cue rdo a e sto se confirma el hecho qu e dentro de e sta longitud de onda se p ercibe un efecto con respecto al aumento en la concentración de etanol en las m uestras. En trabajo s ante riore s se he reportado que lo s picos ca racte rístico s en el espectro para solucione s de etanol-ag ua se en cuentran a: 1696 , 1732, 2084 y

2278nm (Ta kuo, 2004). Esto le da mayor vera cidad a las e cua cione s que se repo rtan en e ste documento.

Lo s re sultado s que se p redicen co n e sta nue va ecu ación se en cuentran en la s tabla s 10 y 11. Com o se aprecia, no hay un cambio significativo con respecto a los valo re s predicho s co n la primera ecuación, ademá s e xiste el mismo comportamiento con re specto a la concentra ción de su strato, y el aum ento que se dio al so bre expresa r el gen pflB e s el m ismo al que se mencionó con anterio ridad.

Tab la 10. Resultados con la segunda ecuación para la cepa Escherichia coli W3110/ pCA24N pflB (4 réplicas). [Glic erol] (g/ L) [E tanol ] (g/ L) Desv iación está ndar 10 0,1882 0,122 15 0,2455 0,491 20 0,2501 0,374

Tab la 11. Resultados con la segunda ecuación para la cepa silvestre (2 réplicas).

[Glic erol] (g/ L) [E tanol ] (g/ L) Desv iación esta ndar 10 0,0280 0,039 15 0,0624 0,054 20 0,0991 0,097

4.5 COM PARACI ÓN CON RES ULTADOS RE PORTADOS E N LI TE RATURA