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Para el análisis de las sub-poblaciones de células T se llevó a cabo una tinción triple con los anticuerpos anti-CD4-FITC/anti-CD8-PE/anti-CD3-PerCP. Las proporciones de células CD4+ y CD8+ se determinaron dentro de una región de células CD3+, a partir de la cual se calcularon las proporciones de células TCD4+ y células T CD8+, como se muestra en la figura 7.
Figura 7. Porcentaje de células CD8+ y CD4+ en las muestras de los pacientes y de
los testigos. Las gráficas que se muestran se realizaron capturando las células dentro en una región CD3+.
Los datos de los linfocitos CD3, CD19+, CD16+56, CD4+ y CD8+ se muestran en la tabla 9, 10, 11,12 y 13:
Tabla 9. Valores absoluto de células T
CD3, sub-poblaciones de células T, células B CD19+ y células NK CD16+56+ en 17 testigos sanos de 1 a 5 años, representado por media, desviación estándar y los límites menor y mayor. CD3 CD4 CD8 CD19 CD16+56 MEDIA 2139 1161 799 466 561 DS 694 483 350 175 370 LÍMITE MENOR 1445 679 449 291 190 LÍMITE MAYOR 2833 1644 1149 640 931 PACIENTE TESTIGO
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Tabla 10. Valores absolutos de células T CD3+, sub-poblaciones de células T, células B CD19 + y células NK CD16+56+ en 17 testigos sanos de 6 a 10 años, representado por la media, la desviación estándar y los límites menor y mayor.
CD3 CD4 CD8 CD19 CD16+56
MEDIA 1884 1035 713 340 394
DS 510 394 235 180 209
LÍMITE MENOR 1374 641 478 159 186
LÍMITE MAYOR 2394 1429 949 520 603
Tabla 11. Valores absolutos de células T CD3, sub-poblaciones de células T, células B CD19* y células NK CD16+56+ en 30 testigos sanos de 11 a 17 años, representado por la media, la desviación estándar y los límites menor y mayor.
. CD3 CD4 CD8 CD19 CD16+56 MEDIA 1682 879 695 294 415 DS 507 233 321 130 233 LÍMITE MENOR 1175 646 374 163 182 LÍMITE MAYOR 2190 1111 1016 424 648
Tabla 12. Valores absolutos de células T CD3+, sub-poblaciones de células T, células B CD19+ y células NK CD16+56+ en 19 testigos sanos de edad adulta, representado por la media, la desviación estándar y los límites menor y mayor.
CD3 CD4 CD8 CD19 CD16+56
MEDIA 1602 911 582 221 449
DS 507 319 245 108 167
LÍMITE MENOR 1095 592 337 113 282
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Tabla 13. Datos de los valores absolutos de células T, sub-poblaciones de células T, células B, células NK de los 25 pacientes.
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Figura 8. Valores absolutos de las poblaciones de células T CD3+, células B CD19+, células NK CD16+56, células T CD4+ y células T CD8+ de los testigos sanos y pacientes pareados por edad. Con los datos de las células T CD3+, las células B CD19+, las células NK CD16+56, las células T CD4+ y las células T CD8+ en mm3 de los testigos sanos (n=76) se dividieron en intervalos de edad; 1 a 5 años (n=20), 6 a 10 años (n=21), 11 a 17 años (n=26) y adultos (n=10) y se calculó el promedio y su desviación estándar. Los valores absolutos de los pacientes, divididos por edad, comparados con X±DS de los testigos sanos en su edad correspondiente. El cuadro negro representa la media de los testigos sanos, las líneas verticales representan sus desviaciones estándar.
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Los hallazgos mostraron que la población de pacientes adultos tuvo una importante disminución de sus poblaciones leucocitarias, pero principalmente de las células TCD4+ y de las células B (fig.5 y 8). Los pacientes que se encontraron en el rango de edad entre 6 y 10 años y 11 a 17 años tuvieron un comportamiento parecido, donde los hallazgos que se encontraron es que ambos mostraron una disminución importante de células B y los pacientes menores de 5 años tuvieron un comportamiento irregular y en la mayoría de los casos sus concentraciones leucocitarias se encontraron por arriba de los valores de referencia para su edad.
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4.- Determinación de las sub-poblaciones de células B
Se determinaron las sub-poblaciones de células B, en la población de células B CD19+ se analizó la expresión de células B CD22+ y CD27+ que corresponde a la población de memoria como se muestra en la fig. 9. Los datos del porcentaje de expresión de los 25 pacientes y 15 testigos sanos se describen en las tablas 14 y 15 respectivamente. El 40% de los pacientes (n=25) tuvieron menos de 20% de células B de memoria comparado con los testigos sanos (n=15), estos últimos ese encontraron entre 30% y 60% con una media de 40%.
Figura 9. Determinación de las sub-poblaciones de células B. En la población de células B CD19+, se determinó el porcentaje de células B de memoria (CD22+, CD27+) y células B maduras (CD22+, CD27-)
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Tabla 14. Porcentaje de células B CD19+, CD22+, CD27+ en 25 pacientes.
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Tabla 15 Porcentaje de expresión de células B CD19+, CD22+, CD27+ en 15 testigos sanos
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Figura 10. Porcentaje de expresión de células B CD22+, CD27+. Los porcentajes obtenidos de células B CD22+, CD27+ tanto de pacientes (n= 25) como de testigos sanos (n=15) fueron comparados. La línea negra representa la media correspondiente.
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5.- Clasificación de los 21 pacientes con CVID de acuerdo a su porcentaje de células B de memoria
Con los datos de la figura 10 se clasificó a los pacientes con CVID (n=21) de acuerdo a sus células B de memoria CD27+, CD22+. Pacientes con menos de 20% de células B de memoria se le asignó como grupo 1(n=8); pacientes con más de 20% células B de memoria se le asignó como Grupo 2 (n=9); pacientes con menos de 1% de células B se les asignó como grupo 3 (n=4). Estos grupos se correlacionaron con los hallazgos del expediente clínico como se muestra en la tabla 16.
Tabla 16. Clasificación de los 21 pacientes con CVID de acuerdo al porcentaje de células B de memoria y sus características cínicas.
49 6.- Análisis de la expresión de CD154
La expresión de CD154 y CD69 (control de activación) se determinó en células T activadas CD3+, como se muestra en la figura 11. Se analizaron 17 pacientes y 7 testigos sanos. Los resultados en porcentaje de los pacientes y testigos sanos se describen en las tablas 17 y 18 respectivamente. Los hallazgos del análisis se muestran en la figura 12. Los pacientes 16, 19, 20 y 22 mostraron una diminución drástica de la proteína CD154, por lo que fueron analizadas para detectar las mutaciones en el gen de CD154.
Figura 11. Histogramas que muestran la expresión de CD154. La expresión de CD154 se determinó en células T activadas CD3+ usando CD69 como control de activación.
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Tabla 17. Porcentaje de expresión de CD154 en 17 pacientes con inmunodeficiencias humorales.
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Figura 12. Análisis de expresión de la proteína CD154 en pacientes y testigos sanos. El porcentaje de expresión de CD154 de los pacientes (n= 17) y testigos sanos (n= 7) fue comparada, la línea negra representa la media correspondiente.
52 7.- Análisis de la expresión de CD40
La expresión de CD40 se determinó en las células B (CD19+) y en los monocitos (CD14+), como se muestra en la figura 13. Se analizó la expresión de CD40 en células B en 18 pacientes y 8 testigos sanos; y en los monocitos en 14 pacientes y 5 testigos sanos como se describe en las tablas 19, 20, 21 y 22. Los hallazgos del análisis se muestran en la figura.14. El paciente 11 expresó de manera muy disminuida CD40 en monocitos, y en las células B no se determinó ya que tuvo una cantidad muy disminuida de estas células.
Figura 13. Histogramas que muestran la expresión de CD40. La expresión de CD40 se determinó en células B (CD19+) y en monocitos (CD14+).
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Tabla 19. Porcentaje de células B que expresan CD40 en 18 pacientes con inmunodeficiencia humoral.
Tabla 20. Porcentaje de células B que expresan CD40 en 8 testigos sanos
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Tabla 21. Porcentaje de monocitos que expresan CD40 en 14 pacientes con inmunodeficiencia humoral.
Tabla 22 Porcentaje de monocitos que expresan CD40 en 6 testigos sanos.
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Figura 14. Análisis de la expresión de CD40 en células B y monocitos de pacientes y testigos sanos. La expresión de CD40 se determino en células B (CD19+) y monocitos (CD14+). Se compararon las poblaciones de los pacientes CD19+ (n=18) y CD14+ (n=14) con las de los testigos sanos CD19+ (n= 8) y CD14+ (n=6). La línea negra representa la media correspondiente.
56 8.- Análisis de la expresión de ICOS
La expresión de ICOS y CD69 (control de activación) se determinó en células T CD3+ activadas como se muestra en la figura 15. Se analizaron 17 pacientes y 7 testigos sanos. Los resultados de los pacientes y controles sanos se describen en la tabla 23 y 24 respectivamente. Los hallazgos del análisis se muestran en la figura 16. Los pacientes 21 y 25 expresan un porcentaje muy bajo de ICOS.
Figura 15. Histogramas que muestran la expresión de ICOS. La expresión de ICOS se determinó en células T CD3+activadas usando CD69 como control de activación.
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Tabla 23. Porcentaje de células T que expresan ICOS en 18 pacientes con inmunodeficiencia humoral
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Figura 16. Análisis de la expresión de ICOS en células T de pacientes y testigos sanos. El porcentaje de expresión de ICOS de los pacientes (n= 18) y testigos sanos (n= 5) fue comparada, la línea negra representa la media correspondiente.
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9.- Análisis de la expresión de TACI en células B maduras
En las células B CD22+ se analizó la expresión de TACI, como se muestra en la figura 17. Se analizaron 17 pacientes y 6 testigos sanos. Los resultados en porcentaje de los pacientes y controles se describen en la tabla 25 y 26 respectivamente. Los hallazgos del análisis de muestran en la figura 18. El promedio del porcentaje de expresión en los testigos (n= 5) fue de 36% y el promedio de los pacientes (n=17) fue de 31.
Figura 17. Histogramas que muestran la expresión de TACI. En las células B CD22+ se analizó la expresión de TACI.
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Tabla 25. Porcentaje de células B maduras que expresan TACI en 17 pacientes con inmunodeficiencia humoral.
Tabla 26. Porcentaje de células B maduras que expresan TACI en 6 testigos sanos
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Figura 18. Análisis de expresión de TACI en células B maduras de pacientes y testigos sanos. En las células B CD22+ se analizó la expresión de TACI, el porcentaje de expresión en los testigos sanos (n= 6) y el de los pacientes (n= 17) se comparó. La línea negra representa la media.