Pacientes y variables clínicas
Se obtuvieron muestras de MO de 259 pacientes al diagnóstico y 15 donantes sanos entre los años 2008-2016. Las muestras procedían del Hospital Universitario de Salamanca y del Hospital Germans Trias i Pujol de Badalona (27 casos de LMMC, cohorte de descubrimiento), y del hospital universitario Morales Meseguer (cohorte de validación: 74 casos de LMMC, 70 SMD, 53 LMA y 25 de LMC). Los pacientes fueron diagnosticados de acuerdo a la clasificación de la OMS de 2008 y 2016 100,265 y en cada caso se obtuvo el consentimiento informado de acuerdo a los protocolos aprobados por cada centro y a la Declaración de Helsinki. Las variables recogidas en los pacientes de LMMC se resumen en la tabla 1.1.
Tabla 1.1: Variables recogidas al diagnóstico en la cohorte de pacientes del estudio.
Demográficas
· Sexo y número de historia clínica
· Fecha de nacimiento, fecha de diagnóstico y edad al diagnóstico
· Antecedentes oncológicos Clínicas
Antecedentes oncológicos Analíticas
· Recuento leucocitario (leucocitos, neutrófilos, linfocitos, monocitos)
· Hemoglobina, plaquetas y volumen corpuscular medio (VCM)
· Lactato deshidrogenasa (LDH), B2 microglobulina, ferritina al diagnóstico y máxima · Hepatomegalia, esplenomegalia Aspirado medular · Blastos MO · Blastos SP · CD34+ MO y SP
· Disgranulopoyesis, diseritropoyesis, distrombopoyesis · Sideroblastos en anillo
Citogenética y biología molecular
Tratamiento y evolución · Tratamiento especifico
· Hidroxiurea, dosis diaria, y tiempo de tratamiento.
· 5-azacitidina, número de ciclos. · Requerimiento transfusional al diagnóstico. · Dependencia transfusional.
· Progresión a LMA, fecha, tratamiento y respuesta.
· Trasplante, tipo, acondicionamiento y respuesta. · Exitus, fecha · Tiempo de seguimiento Clasificación · OMS · FAB Pronóstico · CPSS · IPSS · IPSS-R
Secuenciación de nueva generación de ARN
El ARN extraído a partir de muestras de MO de los 27 pacientes con LMMC de la cohorte de descubrimiento y de 9 controles sanos se utilizó para secuenciación profunda de nueva generación de ARN (RNA-seq). Se utilizó una plataforma secuenciadora HiSeq4000
(Illumina, San Diego, CA, EEUU) obteniéndose una media de 106 millones de lecturas por muestra. En cinco pacientes tratados con azacitidina, una segunda muestra de MO en el día +28 del tercer ciclo fue también secuenciada. Utilizamos el paquete estadístico LIMMA y EDGE-R en el análisis diferencial de expresión.
Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-qPCR), Selección de células CD34+ y análisis por citometría de flujo
Los genes expresados de manera diferencial en la cohorte de descubrimiento fueron validados mediante el uso de experimentos de expresión génica usando sondas TaqmanTM (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, EEUU) (Tabla 1.2).
Tabla 1.2: Sondas comerciales utilizadas en el experimento de validación por RT-qPCR.
Gen Sonda Tamaño del amplicón CDKN1A Hs00355782_m1 66 PARP1 Hs00242302_m1 111 BAP1 Hs00184962_m1 82
58
ACTB Hs99999903_m1 171
Los progenitores hematopoyéticos CD34+ fueron seleccionados tras descongelación de MO criopreservada, utilizando bolas magnéticas en un autoMACs® Pro Separator (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Germany).
El compartimento granulomonocítico fue cuantificado en la cohorte de descubrimiento mediante la siguiente combinación de anticuerpo-fluorocromo: CD11b-FITC, CD13-PE, CD45-PerCP y CD34-APC, utilizando un citómetro de flujo FACSCantoTMII (Becton Dickinson , San Jose, CA, USA).
Análisis de la metilación de ADN por pirosecuenciación
Las secuencias de los cebadores fueron diseñadas para que hibridaran en las regiones libres citosina-fosfato-guanina (CpG) para confirmar la amplificación independiente de metilación (Tabla 1.3).
Tabla 1.3: Secuencias de los cebadores para el experimento de pirosecuenciación
La conversión por bisulfito de 500 ng de ADN de cada muestra se realizó usando el kit EZ DNA Methylation-Gold (Zymo Research, Milán, Italia) de acuerdo a las recomendaciones del fabricante. Tan solo aquellos valores medios de metilación dentro de la región analizada que presentaron un coeficiente de variación < 1 fueron aceptados como válidos. Controles que aseguraran una correcta conversión por bisulfito del ADN se incluyeron en cada experimento, así como controles en la secuenciación para confirmar la fidelidad de las medidas.
Secuenciación dirigida del ADN
Diseñamos un panel TruSeq Custom Amplicon (Illumina, San Diego, CA, EEUU) que incluía 18 genes recurrentemente mutados en neoplasias mieloides y que cubría 24975 bases. En algunos genes con regiones donde se concentran las mutaciones somáticas descritas, tan solo esas regiones “hotspot” fueron secuenciadas; en aquellos otros casos en los que las mutaciones descritas estaban ampliamente distribuidas a lo largo de toda la secuencia codificante se diseñó la cobertura de todos los exones (Tabla 1.4). El tamaño medio de cada amplicón fue de 151 pares de bases (pb) y aproximadamente el 99% de las regiones se cubrieron en ambos sentidos. La preparación de las librerías se realizó de
Región CpG Cebador en posición forward Cebador en posición reverse Cebador de se
CDKN1A_CpG_1 GGTGTAGGGAGATTGGTTTAATG TAAACACCCCAACAAAACATCTTAA ATTTTTTTATTTGTGAAAT
CDKN1A_CpG_2.3 AAGGGGGTTTATTTTAATAGTGTT CTTCCCTCCTCCCCCAAT AAAAAGTTAGATTTGTGGT
acuerdo a las instrucciones del fabricante. La secuenciación (2x150 pb) de ambos extremos fue realizada con tecnología MiSeq V2.2, con una media de profundidad de 982 lecturas por base.
Tabla 1.4: Diseño de los amplicones de la secuenciación dirigida
GEN Cromosoma Exón/es Amplicones
TET2 4 3‒11 97 SRFS2 17 1 5 ASXL1 20 12-13 8 CBL 11 8‒9 4 KRAS 12 2‒3 4 SETBP1 18 4 4 JAK2 9 12, 14 3 IDH2 15 4 2 U2AF1 21 2, 6 4 NRAS 1 2‒3 3 IDH1 2 4 3 TP53 17 2‒11 15 FLT3 13 14, 15, 20 5 SF3B1 2 13‒16 9 DNMT3A 2 1-23 38 EZH2 7 1-20 32 RUNX1 21 1-12 19 ZRSR2 X 1-11 19 TOTAL 274
Análisis del espliceosoma
Los sitios de splicing 3’ y 5’ alternativos, y las alteraciones en la retención o exclusión de exones, fueron cuantificadas utilizando rMATS utilizando el ensamblaje resultasen del uso del paquete estadístico STAR. 266.
Los resultados fueron filtrados empleando una tasa de falsos positivos <0.05 y destacando solo aquellas diferencias en cuanto a la inclusión que oscilaran entre >0.05 o <0.05. Los eventos de splicing alternativos fueron representados mediante gráficas tipo sashimi utilizando el software MISO. 267
Los resultados fueron revisados y filtrados utilizando la herramienta informática Zegami (http://zegami.com/).
Bases de datos públicas
Analizamos el perfil de metilación de 22 muestras de MO de pacientes con LMMC y 4 controles sanos procedentes del uso de microarrays tipo HumanMethylation27 Beachip, hechos públicos a través del número de acceso Gene Expression Omnibus (GEO) GSE31600. 268
Además, datos del transcriptoma obtenidos por microarray de los genes de reparación del ADN fueron extraídos de las bases de datos del estudio MILE, hechos públicos a
60 través de GEO con el número de acceso GSE13204.
Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó utilizando el paquete estadístico SPSS (versión 21.0 Armonk, NY: IBM Corp). Se utilizó el test t-Student o U Mann-Whitney en las comparaciones de las variables cuantitativas entre dos grupos según procediera por el tamaño muestral y la distribución de la variable. Utilizamos el método de Kaplan Meier analizando la supervivencia entre grupos comparándola por el test Log-rank. Establecimos la significación estadística en un valor bilateral de 0.05, excepto para los valores de p en las comparaciones múltiples, donde aplicamos la corrección BonFerroni.