Pacientes sin mutación detectable

En nuestra experiencia de 271 casos de hemofilia A estudiados para determinar su patología molecular, en 267 fue posible establecerla a partir de la metodología disponible. En cuatro casos (1,5%) los resultados fueron negativos. Este hecho, había sido descrito por otros autores anteriormente (Kloop et al, 2002; Guillet et al, 2006; Jayandharan et al, 2005). Dichos resultados no dejan de ser sorprendentes, dado que hasta hace poco, se consideraba que la causa de que una proteína estuviera alterada o no funcionara solo podía corresponder a una mutación en la secuencia del gen correspondiente.

De los cuatro casos, uno se trataba de un síndrome de Klinefelter (47,XXY) que presentaba una hemofilia grave y que por estudio de marcadores se determinó que ambos cromosomas X provenían de su madre. Asimismo se trataba del mismo cromosoma, lo que indicaba que había ocurrido una no-disyunción en la segunda división meiótica. Todos los estudios moleculares dieron normales y entonces se sometió la muestra al estudio de dosis génica por MLPA. Dicha técnica indicó que había una deleción parcial de los exones 1 al 12 del gen F8 y que el otro alelo, era normal (ver sección de resultados pág. 141). La explicación más plausible de este caso es que se trate de una deleción de novo en uno de los genes F8 y que hubiera una inactivación extrema fundamentalmente en hígado, del cromosoma portador del gen F8 que no presenta la deleción, lo que explicaría la clínica de hemofilia en este paciente. Este mecanismo se ha descrito en algunos de los casos de mujeres portadoras con clínica de hemofilia (Bennett et al, 2008). En la mayoría de los estudios de

inactivación de X en mujeres, era posible diferenciar ambos cromosomas X (el paterno del materno). Sin embargo en este caso, el cromosoma X extra de este paciente era el mismo. El estudio del gen del receptor de andrógenos resultó con igual número de repeticiones CAG en ambos alelos por lo tanto, no era posible realizar estudios de inactivación del X con enzimas de restricción sensibles a la metilación. El otro paciente se trataba de una hemofilia A grave, sin ninguna alteración molecular detectada por estudio de inversiones y secuenciación directa del gen, sin embargo, el análisis de MLPA indicó una duplicación de los exones 2 al 10. Su madre y hermana eran portadoras de dicha duplicación. Las grandes duplicaciones (de un exón o más) dentro del gen F8 han sido recientemente descritas como causa molecular de la hemofilia en un grupo de pacientes con HA cuya patología molecular no se había podido definir previamente (Acquila et al. 2008, Rost et al 2008).

Por último, los otros dos casos se trataban de pacientes con HA leve esporádica(caso 3) y HA leve familiar (caso 4) (ver sección de resultados pág. 145) en los que el análisis de MLPA, a diferencia de los dos casos anteriores, no fue efectivo para determinar su alteración molecular. En estos pacientes, asumiendo que el diagnóstico es correcto, las posibles hipótesis para explicar su cuadro clínico serían:

(a) mutaciones en el propio gen F8:

(a1) alteraciones en zonas internas del intrón que regula de alguna manera el splicing, provocando la pérdida de exones que no detectamos en el análisis de ADN (generación de sitios crípticos de splicing)

(a2) mosaicismo somático de baja frecuencia que hace que no se detecte la mutación del F8 en el ADN que obtenemos de linfocitos de sangre periférica y que podría estar presente en hígado.

(b) Mutaciones en los elementos que regulanla expresión génica de F8,

(b1) Elementos que actúan en cis, como las regiones promotoras que determinan la posición y la eficacia de la transcripción. A este respecto, se ha descrito la ausencia de mRNA de F8 estructuralmente normal como un nuevo mecanismo que ocasiona HA grave (El-Maarri et al, 2006)

(b2) Elementos que actúan en trans, como podrían ser, los factores de la transcripción, estos son fundamentales para que se una la polimerasa y comience la transcripción.

(c) Mutaciones en genes que codifican proteínas relacionadas con el FVIII

(c1) Aquí se consideran las proteínas responsables del transporte del FVIII desde el retículo endoplasmático al aparato de Golgi, ERGIC-53 y MCFD2, dado que mutaciones en ambas proteínas o en alguna de ellas provoca una deficiencia combinada de FV y FVIII (F5F8D). Normalmente este déficit va asociado a un fenotipo leve o moderado de tendencia de sangrado. La frecuencia de esta patología es extremadamente rara (1:1,000.000) en la población general (Spreafico y Peyvandi, 2009)

(c2) Proteínas que actúan en la modificación postraduccional del FVIII(Berdard et al, 2005).

En los pacientes tres y cuatro en ninguna de sus secuencias, incluyendo los promotores (Dai et al, 2009) de cada uno de ellos se hallaron cambios que justifiquen una alteración en el funcionamiento del gen y no se disponía de RNA para determinar si había fallos en la transcripción comprobando la presencia o no de mRNA del F8. De todas formas, es probable que un fallo en la transcripción predeciría una hemofilia grave, como la del caso publicado por El-Maarri et al, (2006). La dificultad es aún mayor si se tiene que cuantificar el grado de expresión del F8 en RNA de sangre periférica por la imposibilidad de obtener RNA de hígado, que sería donde se expresa fundamentalmente. De esta forma, el disponer de RNA de estos pacientes podría ayudar a descartar alguna de estas hipótesis. (El-Maarri et al, 2005).