Participación de las especies activas

Durante el desarrollo del proceso de nodulación, desde la detección mutua planta- microsimbionte en la rizosfera, hasta el desarrollo del nódulo maduro y funcional, las EAO juegan roles claves (Santos et al. 2001; Ramu et al. 2002; Pauly et al., 2006; Lee MY et al., 2005; Cárdenas et al. 2008; Muñoz et al., 2012). Se ha reportado en Medicado truncatula una reducción en los flujos de EAO luego de 20-30 minutos de la aplicación de factores Nod y mutantes que no nodulan no muestran esta respuesta frente a factores Nod (Shaw y Long, 2003). Algunos autores sugieren que una represión en la producción de EAO podría tener algún papel clave y específico en la deformación del pelo radical durante la interacción rizobio-leguminosa (Lohar et al. 2007; Cardenas et al. 2008).

80 Entre las primeras respuestas locales luego de la percepción mediante receptores específicos de simbiosis, ocurre un incremento rápido y transitorio de EAO intracelulares en los pelos radicales luego de aproximadamente 3 min de aplicado el factor Nod. Posteriormente, tiene lugar una caída en el contenido de EAO intracelular, siendo esta respuesta específica para elicitores simbióticos. Contrariamente, tratamientos con quitosan, un elicitor de patógenos fúngicos, no muestran la caída posterior al pico de generación de EAO, observándose un incremento sostenido en el tiempo de los niveles de

EAO intracelulares (Cárdenas et al., 2008). Asimismo, mediante aproximaciones

farmacológicas utilizando ioduro de difenilo (DPI), un inhibidor de flavo proteínas comúnmente usado para inhibir la actividad del complejo NADPH oxidasa, se ha sugerido que esta dinámica de producción intracelular de EAO es dependiente de la actividad de dicha enzima (O’Donnel et al. 1993). Recientemente, también se ha involucrado al complejo NADPH oxidasa en el funcionamiento de los nódulos (Marino et al., 2011).

El análisis en mutantes de Arabidopsis thaliana rhd2-1 indican que la enzima de membrana plasmática NADPH oxidasa AtRBOH C es requerida para la producción localizada y oscilatoria de EAO durante la elongación del pelo. Curiosamente, en estas mutantes el “nacimiento” del pelo radical a partir de un tricoblasto epidérmico no está afectada. En estos mutantes los pelos radicales estallan cuando comienza el período de elongación sugiriendo que las EAO estarían involucradas en la rigidización de la pared celular. Asimismo, en pelos radicales no mutantes si se agrega peróxido de hidrógeno exógeno la elongación se detiene y si se agrega un secuestrante del mismo, la elongación se promueve (Swanson y Gilroy 2010).

Algunas vías estudiadas de regulación de la actividad de esta enzima incluyen, activación por fosfolípidos, calcio y disponibilidad de poder reductor (NADPH). Pequeñas GTPasas, ROP-GTPasa (Jones et al. 2007) y RhoGDI (Rachel y Dolan 2006) han sido recientemente citadas como importantes reguladoras de la producción de EAO por NADPH oxidasa durante el crecimiento del pelo y la percepción de factores Nod (Skupek y Irving 2006). Asimismo se las ha observado asociadas al movimiento de vesículas, al control funcional-espacial de la actividad NADPH oxidasa (Terada 2006; Takeda et al. 2008) y mediando eventos de muerte celular (Park et al. 2004).

La generación de EAO es un denominador común en presencia de diversos tipos de estrés. Su homeostasis y fina regulación espacio temporal es clave ya que también participan en vías de señalización del desarrollo, en la percepción de diferentes estímulos químicos y físicos, en la interacción de la planta con microorganismos, etc. En este sentido la regulación y mantenimiento del estado redox intracelular en presencia de estrés, se convierte en un aspecto esencial para el mantenimiento de funciones celulares que permitan la ocurrencia de la interacción simbiótica con rizobios.

81 La producción de EAO es analizada en forma general como generación de peróxido de hidrógeno intracelular, sin detallar posibles diferencias de producción apoplástica e intracelular asociadas a la actividad del complejo NADPH oxidasa. Nuestro grupo de trabajo ha caracterizado en una cinética detallada durante la interacción soja-B.

japonicum, la generación intracelular de EAO y apoplástica de radical superóxido, y se ha

sugerido que la generación apoplástica de radical superóxido vía la actividad de NADPH oxidasa en presencia del microsimbionte, sostiene la curvatura del pelo radical mediante la relocalización asimétrica de su producción y el efecto sobre la rigidización de la pared celular. Se indicó también la ocurrencia de un incremento transitorio de EAO intracelulares pocos minutos después de la inoculación con B. japonicum en pelos radicales de soja y que esta respuesta es necesaria para que el proceso de percepción y/o infección ocurra (Muñoz et al., 2012).

La generación de EAO ha sido también analizada en etapas más avanzadas de la infección que incluyen la formación del hilo de infección. Se ha citado que la disparidad en el gran número de pelos radicales infectados respecto del número final de nódulos formados implica un importante control en la infección, donde el aborto de hilos de infección es de especial importancia y se ha observado que estos hilos de infección que se detienen contienen grandes cantidades de peróxido de hidrógeno (Vasse et al. 1993; Santos et al. 2001). Se sugirió entonces que, durante la formación del hilo de infección podrían ocurrir reacciones de tipo hipersensible que impedirían el ingreso de un gran número de eventos de infección en una misma raíz, generando principalmente estrés oxidativo en los microsimbiontes que ingresan en la raíz (Vasse et al. 1993). Investigaciones posteriores, demostraron que esta generación de peróxido de hidrógeno en los hilos de infección no genera estrés oxidativo en el rizobio y que cumple un rol crucial en optimizar el desarrollo del hilo de infección, posiblemente participando en el entrecruzamiento de glicoproteínas necesarias para mantener la estructura del hilo de infección (Jamet et al. 2007).

4.2. Participación del tráfico de vesículas en la interacción