PCR de fragmentos grandes

Se han usado dos sistemas diferentes: Expand High Fidelity PCR System (Roche, ref. 03 310 256) para fragmentos de ~4-7 Kb; y Expand long template PCR system (Roche, ref. 11 681 834 001) para amplificar fragmentos mayores de ~7 Kb.

La reacción de PCR se realizó a partir de 100 ng de ADN en un volumen final de 25 µl, en el que se añadieron: 2.5 µl tampón 1 (10x con 17.5 mM MgCl2), 4 µl dNTPs (40 pmoles), 0.75 µl de cada primer (7.5 pmoles), 15.65 µl H2O y 0.35 µl enzima (1.75 U). Las muestras fueron amplificadas tras 4 minutos de desnaturalización a 94ºC, 10 ciclos de preamplificación (94ºC durante 30’’, 55-57ºC durante 30’’, 68ºC durante 7-10’), 20 ciclos de amplificación (94ºC durante 30’’, 55-57ºC durante 30’’, 68ºC durante 7-10’ aumentando 20’’ cada ciclo), y una extensión final a 68ºC de 15’. Los resultados se comprobaron migrando los productos de PCR en un gel de agarosa al 0.8-1% teñido con bromuro de etidio.

4.3.2 Secuenciación

La mezcla de secuenciación que se ha empleado es la BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit (Applied Biosystems), a partir de una dilución 1:10 del producto de PCR a secuenciar. En la reacción de secuenciación se añaden:

La amplificación de PCR empleada fue de 30 ciclos (96ºC durante 10’’, 50ºC durante 5’’, 60ºC durante 4’) tras una desnaturalización previa de 4’ a 94ºC.

- A continuación se precipita el ADN con 62.5 µl Etanol 100%, 24.5 µl H2O y 3 µl NaAc 3M.

- Se incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente. - Se centrifuga durante 20 min a 13000 rpm.

- Se decanta el sobrenadante. - Se añaden 250 µl Etanol 70%.

- Se centrifuga 5 minutos a 13000 rpm.

- Se elimina el sobrenadante y se deja secar en una estufa a 37ºC.

- Se procesa en el secuenciador automático ABI3100 (Applied Biosystems).

4.3.3 Southern blot

Se ha realizado esta técnica a partir de ~10 µg de ADN genómico de la paciente de la translocación 1 y un ADN control.

Las sondas que se usaron para detectar la presencia de un determinado fragmento son secuencias de ADN de ~400 pb, que se generaron a partir de una PCR específica. El método de detección usado ha sido mediante marcaje radiactivo con α-32P dCTP. Para revelar la radiactividad que haya quedado impresa en la pantalla usamos el lector (Phosphoimager) Typhoon 8600, mediante el programa Typhoon Scanner.

Digestión del ADN del paciente y de un control

- Se digieren 10 µg de ADN en una reacción con 5 µl de tampón de digestión (A, B o H dependiendo del enzima de restricción),

H2O y 10 U enzima en un volumen total de 50 µl. En este caso hemos empleado los enzimas EcoRI, HindIII, BamHI y XbaI.

- Se digiere durante toda la noche en una estufa a 37ºC.

Gel de agarosa

Las muestras de ADN digeridas se migran en un gel de agarosa al 0.8% durante toda la noche en una cubeta de electroforesis a bajo voltaje (50-60 mV).

Pretratamiento del gel

- Se incuba el gel en agitación con HCl 250 mM para fragmentar el ADN, durante 10 minutos.

- Se aclara con H2O destilada.

- Para desnaturalizar el gel, se realizan 2 incubaciones de 15 minutos cada una en solución desnaturalizante.

- Se aclara con H2O destilada.

- Se realizan 2 incubaciones con tampón de neutralización para neutralizar el pH alcalino de la solución desnaturalizante. - Se aclara con H2O destilada.

Transferencia por capilaridad

Para transferir el ADN desnaturalizado a una membrana de nylon Hybond N+ (Roche) se realiza un montaje en el que se usa como tampón de transferencia 10XSSC. Antes de transferir, se pretrata la membrana sumergiéndola unos 10 minutos en el tampón de transferencia. Se llena una cubeta con el tampón, y se coloca un cristal y un papel Watman en contacto con el tampón. Sobre este papel se colocan otros dos papeles Watman de un tamaño similar

dos papeles Watman y múltiples capas de papeles de filtro con un peso de 1 Kg aproximadamente en la parte superior, como se puede observar en el siguiente esquema:

Fig. 15. Esquema del montaje para la transferencia de gel a membrana en un southern blot.

Esto permitirá que el ADN ascienda por capilaridad y se imprima en la membrana de nylon. Se deja el montaje de transferencia durante toda la noche. Al día siguiente, para comprobar la correcta transferencia de ADN, se desmonta el blot y se observan en el transiluminador tanto la membrana como el gel.

Fijación del ADN a la membrana de nylon

- Para fijar (hacer un crosslink) el ADN a la membrana se emplean rayos UV (Bio Link Crosslinker 254 nm, Biolan); con el programa C3: 150 mJ.

- La membrana se aclara después con H2O destilada. Si necesita almacenarse se guarda entre papeles Watman a 4ºC.

Prehibridación de la membrana

Se incuba la membrana en la solución de prehibridación a 65ºC durante 90 minutos. La membrana se coloca en un cilindro de metacrilato con el ADN hacia la parte interior. La incubación se realiza en un horno con sistema rotatorio.

Obtención de la sonda: purificación de ADN a partir de gel de agarosa

Las sondas que usamos para detectar la presencia de un determinado fragmento en un Southern blot son secuencias de ADN de ~500 pb. Estas secuencias se generan a partir de una PCR específica para esta región. Para comprobar la especificidad de esta secuencia, primero se compara con el ADN de referencia mediante el programa BLAT (http://projects.tcag.ca/humandup/) para descartar la presencia de regiones repetitivas. Una vez diseñados los cebadores y realizada la PCR, se comprueba el resultado migrando el producto en un gel de agarosa, para recortar y purificar la banda obtenida. La purificación se realizó mediante el kit comercial GFXTM PCR and Gel Band Purification kit (Ref. 27- 9602-01) de Amersham Biosciences, siguiendo las instrucciones del proveedor.

Marcaje de la sonda con radioactividad

- Se diluyen 50 ng de ADN de la sonda en un volumen final de 45 µl con TE 1x.

- Se desnaturaliza la sonda hirviendo en un baño maría a 100ºC durante 5 minutos.

- Se traspasan los 45 µl a un nuevo tubo que contiene random primer de Amersham (dATP, dGTP, dTTP, hexámeros random y enzima Klenow; liofilizado).

- Se añaden 4 µl de alpha 32P dCTP (10 µCi/µl; Perkin Elmer).

- Se resuspende bien y se incuba durante 10 minutos a 37ºC en un termoblock.

- Se preparan las columnas de purificación de resina (Sephadex), que retienen el 32P libre no marcado.

- Se depositan los 50 µl de sonda marcada en la parte superior de la columna y se centrifuga durante 3 minutos a 2000 rpm.

- En el tubo colector quedará la sonda marcada; para desnaturalizarla se añaden 5 µl de NaOH 4M.

Hibridación

- Se decanta la solución de prehibridación y se cambia por solución de hibridación precalentada a 65ºC.

- Se añaden los 55 µl de sonda desnaturalizada directamente en la solución de hibridación, sin tocar la membrana.

- Se deja hibridando durante toda la noche en un horno rotatorio a 65ºC.

Lavados posthibridación

- Se realizan 2 lavados de 20 minutos cada uno con 2xSSC 0.5%SDS, primero a 42ºC y después a 60ºC.

- Se realizan dos lavados de 20 minutos con 0.5xSSC 0.5% SDS a 60ºC; todos en el horno con rotación.

Exposición de la membrana

- Se envuelve la membrana en plástico y se coloca en contacto con una pantalla dentro de un cassette revelador (Molecular Dynamics).

- Se deja exponiendo toda la noche a temperatura ambiente. Para revelar la radiactividad que haya quedado impresa en la pantalla se usa el lector (phospho imager) Typhoon 8600, mediante el programa Typhoon Scanner.

SOLUCIONES: