PCR (REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA) 1 Primers Utilizados

Los primers que se usaron amplificaron el gene 18S, y fueron sintetizados por el Laboratorio Invitrogen, usando secuencias de la sub-unidad pequeña del gene ribosomal (Ssu-rDNA). Debido a que se realizó una PCR semianidada donde se realizan dos amplificaciones sucesivas, se utilizaron inicialmente un juego de primers el 18ST nF2

(CAACGATGACACCCATGAATTGGGGA) y 18ST nR3 (TGCGCGACCAATAATTGCAATAC) como primer reverso, y para la segunda

amplificación, se utilizaron otro juego de primers que se unieron a sitios blanco internos de los productos de la primera amplificación, obteniendo otros productos diferentes de PCR. Para ello se empleó un primer idéntico al que se utilizó en la primera amplificación, el 18ST nF2, y otro primer antisentido que difiere totalmente de los utilizados en la primera amplificación, y fué el 18ST nR2 (GTGTCTTGTTCTCACTGACATTGTAGTG) (Geysen et al, 2003). La PCR semianidada es una modificación a la PCR anidada, y se basa exclusivamente en que uno de los primers internos (forward o reverse) cambia en estructura con relación a los empleados en la primera amplificación, mientras que el otro primer interno, mantiene o es idéntico a alguno de los utilizados en la primera amplificación. En toda amplificación por PCR, el cambio de primers es necesario, ya que los productos de PCR dan inespecíficos si se amplifican con los mismos, en reacciones sucesivas.

3.5.2. Amplificación de DNA por PCR semianidado

Esta técnica es una modificación de la PCR anidada, como se encuentra explicado anteriormente, la cual permite separar, identificar, depurar y amplificar, pequeñas cantidades de ADN entre cientos de miles y millones de veces. El tramo destinado a reproducirse puede tener desde cincuenta hasta más de dos mil nucleótidos de longitud. El segmento de ADN que sirve de molde no requiere estar necesariamente en estado puro, sino que puede ser parte de mezclas complejas. Puede ser, por ejemplo, ADN nuclear total o DNA mitocondrial (Satz & Kornblihtt ,1993 ; Njuguna et al (1997)).

El método se basa, en su forma más simple en la realización de tres reacciones sucesivas llevadas a cabo a distintas temperaturas. Estas reacciones se repiten cíclicamente entre veinte y cuarenta veces. En la primera fase, la muestra se calienta hasta lograr la separación de las dos cadenas que constituyen el ADN, hecho que se conoce como "desnaturalización".

En la segunda fase, la temperatura se reduce para permitir el "apareamiento" de cada una de dos cadenas cortas de nucleótidos (oligonucleótidos) con cada una de las hebras separadas del ADN molde. Se trata de segmentos de ADN de cadena simple, sintetizados en el laboratorio y diseñados de manera tal que permiten definir los límites del tramo de ADN que se desea replicar. Obviamente, para que se pueda producir el apareamiento, cada uno de estos oligonucleótidos, a los que se denomina "iniciadores" o primers, debe ser complementario del tramo al que tienen que unirse en las cadenas separadas del ADN molde.

En tercer lugar, una enzima ADN polimerasa extiende los primers, en el espacio comprendido entre ambos, sintetizando las secuencias complementarias de las hebras del ADN molde. Para ello, la ADN polimerasa usa desoxidonucleósidos trifosfato (dNTPs) agregados a la mezcla de reacción.

La temperatura a la que se realiza el tercer paso está condicionada por aquélla a la cual "trabaja" la enzima ADN polimerasa. Al cabo del primer ciclo de tres reacciones (desnaturalización, apareamiento, extensión) el tramo de ADN elegido se ha duplicado y el doble de su cantidad original se encuentra disponible para ser nuevamente replicado en un segundo ciclo. El resultado de la aplicación de numerosos ciclos "en cadena" da lugar a la amplificación geométrica del segmento de ADN delimitado por los primers (Satz & Kornblihtt,1993, Stansfield, 1998, Geysen, 2003).

Las diferentes muestras de DNA se deben someter a electroforesis en gel, donde las muestras de DNA se ubican en pozos y corren a través de los poros del material gelatinoso. La corriente electrica hace mover las moléculas de DNA cargadas negativamente hacia el polo positivo. Fragmentos cortos de DNA corren más rápidamente por los poros del gel que los de tamaño más grande, separándose el DNA en bandas de diferentes tamaños (Satz & Kornblihtt ,1993).

Con el ADN del T.vivax, T.evansi y T.theileri, se realizaron amplificaciones estándar de PCR mezclando reacciones de 25 µl. Para ello se mezclaron 5 µl de muestra de DNA, 50nM de KCl, 10nM Tris-HCL (pH 8.3), 1.5nM MgCl2, 200µM por cada dNTP

(desoxirribonucleótidos trifosfatos), 20pmol de cada primer y 0.5U enzima Taq polimerasa (Promega® M166B).

La mezcla de 25 µl, se ubicò en el Termociclador para comenzar con el programa de amplificación, el cual se inició con el paso de la denaturalización durante 4 min a 94oC, cada 40 ciclos consistieron en 60 seg a 94oC, 90 seg a 58oC y 120 seg a 72oC. En el programa se adicionaron 10 min de extensión a 72 oC y posteriormente a 4oC hasta retirar la muestra.

De cada muestra, se tomó un volumen de 5µl, y se sometiron a electroforesis en gel de agarosa al 2% el cual fue teñido con 5 µl Bromuro de Ethidio. En la camara de electroforesis las muestras estuvieron por 30 min a 100 V (Geysen et al 2003).

Del producto de la primera amplificación, se tomó 1 µl, se le adicionó a 24 µl de la master mix. La Master mix se encontraba compuesta de 17.75 µl de agua, 2.5 µlde Buffer de carga, 1.5 µl de MagCl2, 1.25 µl de DNTPs, 0.25 µl de cada primer y 0.5 µl de la enzima Taq polimerasa. El programa de la segunda amplificación, fue idéntico al de la primera amplificación, excepto por 25 ciclos. El control negativo que se utilizó para las muestras con Trypanosoma, consistió en una muestra de sangre bovina parasitada al 6% con Babesia bigémina, cedida por los Laboratorios Limor de Colombia.

Se tomaron 5µl del producto de la segunda amplificación, se sometieron a electroforesis en mini geles de 2% de agarosa, teñidas con 5 µl de Bromuro de Ethidio con una escala de 100 bp de DNA para la determinación del tamaño del fragmento. Las muestras fueron corridas por 30 min a 100 V, y fotografiadas bajo iluminación UV (Geysen et al 2003).

3.6. DIGESTIÓN POR MEDIO DE POLIMORFISMO DE FRAGMENTOS DE