O 2 i ) en una planta de melojo del tratamiento T2.
3.2. Experimentos en campo
3.2.1. Plantaciones en La Maleza
Se trata de un pinar plantado en 1958. Las parcelas de estudio se situaron en una ladera de pendiente suave (~ 15 %) orientada al sureste, en tres zonas con distinta densidad de arbolado: una zona de pinar con la densidad original (1067 pies ha-1, 65,8 m2 ha-1 de área basimétrica, y 22,5 m de altura dominante), una zona de pinar aclarado en 1998 contigua y al mismo nivel que la anterior (800 pies ha-1, 53,6 m2 ha-1 de área basimétrica, y 21,6 m de altura dominante), y un cortafuegos adyacente de 10 m de ancho realizado en 1992 que separa el pinar del Hayedo, y que representa un claro de tamaño medio (Fotografía 3.2). La vegetación es abundante en el cortafuegos (Genista florida L., Adenocarpus hispanicus (Lam.), Rubus ulmifolius Schott. y Lonicera peryclimenum L.entre los taxones más abundantes), pero es escasa en la zona de pinar, sobre todo en el de mayor densidad donde sólo Pteridium aquilinum L. (Kuhn) forma pequeños rodales.
Fotografía 3.2. Los tres sitios se encontraban en un transecto de ≈150 m con orientación SW-NE.
Se hicieron tres plantaciones en distintos años. En la primera de ellas (año 2000) se incluyó una zona desarbolada dentro del Hayedo pero no se plantó en el cortafuegos. En la tercera plantación (año 2004) los individuos se protegieron con protectores individuales, para evitar daños por herbívoros.
Material y métodos
- Primera plantación (anexo III)
Entre febrero y marzo de 2000 se plantaron 500 brinzales de roble albar y 500 de melojo, de una savia, previamente cultivados en vivero sin restricciones de agua o nutrientes. Doscientos cincuenta individuos con cepellón de cada especie se distribuyeron en el pinar entre la zona aclarada y la que mantiene la densidad original de plantación. No fue necesaria la eliminación de la vegetación preexistente antes de proceder al ahoyado manual. Otros 250 individuos de cada especie se plantaron en una zona sin cubierta arbórea dentro del Hayedo conocido como “Rozallano” (Fotografía 1.1 b), en fajas de dos metros de ancho donde el matorral, principalmente de Adenocarpus hispanicus, A. complicatus y Juniperus communis, fue desbrozado previamente a la instalación de los plantones. No hubo ninguna otra preparación del terreno. El suelo en esta zona apenas alcanza los 60 cm de profundidad, frente a los más de 100 cm que tiene en muchos puntos del pinar.
Se examinó la supervivencia al cabo del primer y cuarto año (octubre de 2000 y 2003). La luz en cada sitio se evaluó a partir de fotografías hemisféricas (n = 30 en las dos zonas de pinar; n = 10 en el claro). Las fotografías se tomaron en días nublados o al atardecer, para evitar la exposición directa a la luz solar, con una cámara analógica Nikon FM a la que se le había acoplado una lente de 8 mm de tipo “ojo de pez”. Las fotografías fueron posteriormente digitalizadas (Olympus ES-10, Olympus Optical Co Europe GMBH) y analizadas con un programa informático (Hemiview 2.1 Canopy Análisis Software, Delta T Devices Ltd., UK). La humedad del suelo se midió por medio de un sistema por reflectometría TDR (Time Domain Reflectometry; Trase System I, Soil Moisture Equipment, USA), que permite determinar el contenido volumétrico de agua en el suelo a partir del cálculo de la constante dieléctrica. Se midió la humedad hasta 80 cm de profundidad en tres tubos de PVC de 1 m de longitud, por sitio. No se pudieron instalar tubos en “Rozallano” por lo que se tomaron los valores del cortafuegos como aproximación. Ambas variables se midieron a lo largo del verano de 2003.
También se midieron el potencial hídrico foliar (PMS Instrument Co 7000, Corvallis Oregon, USA), y la eficiencia fotoquímica potencial del fotosistema II (Fv/Fm)
(FMS 2, Hansatech Instruments Ltd., UK) en cinco plantas por especie y sitio, al amanecer y a mediodía. Las medidas se realizaron en las primeras semanas de julio y
Material y métodos agosto de 2002 (tercer año en campo), y julio, agosto y septiembre de 2003, aunque en este último año no se pudo medir en el claro.
La valoración del efecto del lugar de plantación, la fecha y la especie en las variables se hizo con análisis de la varianza. Cuando la interacción entre factores resultó significativa (interacción máxima de segundo orden), se analizó el efecto de uno de ellos para cada uno de los niveles del otro. El potencial hídrico al amanecer se tomó como covariable para comparar los datos de Fv/Fm. La normalidad de los datos se
comprobó a través de la representación gráfica de la distribución de los datos. La homocedasticidad se examinó visualmente con gráficos de cajas y bigotes, y con la aplicación de los tests de Cochran y Bartlett. Los datos se transformaron con operadores matemáticos cuando no eran normales u homocedásticos.
- Segunda plantación (anexos IV a VI)
En marzo de 2003 se plantaron 90 brinzales por especie, repartidos bajo el pinar aclarado y sin aclarar, y el cortafuegos, en tres bloques completos distribuidos a lo largo de la pendiente, cada uno con 30 plantas por especie situadas entre las hileras de pinos separadas aproximadamente 1,5 m (diseño Split-Plot). Las plantas, de una año de edad en el momento de su plantación, fueron cultivadas previamente en vivero en envases de 15 cm de profundidad; se transplantaron con cepellón en hoyos de aproximadamente 40×40×40 cm excavados manualmente. Algunos individuos fueron comidos el primer año, por lo que se protegieron con una malla de alambre rígido de 1 cm de luz en el siguiente. Durante los dos años que siguieron a la plantación se examinó el microclima de cada sitio, y se evaluó el desarrollo de los brinzales determinándose distintos parámetros fisiológicos y morfológicos al comienzo (final de junio) y al final del verano (final de agosto).
Caracterización microclimática
En cada sitio se examinó la humedad del suelo a distintas profundidades, la humedad y la temperatura del aire, y el régimen lumínico (irradiación relativa y duración de los periodos de luz directa).
Material y métodos
uno en cada bloque de plantas). No se pudo medir la humedad del suelo por debajo de los 60 cm de profundidad debido a la entrada de agua en los tubos. La humedad y temperatura del aire se registraron por medio de sensores conectados a un compilador de datos (HOBO H8 Pro, Onset); se programaron para tomar un registro cada 10 min. Se colocó un equipo de medida por sitio. Con los valores de humedad relativa y temperatura se calculó el déficit de presión de vapor del aire. Para evaluar el régimen de luz de cada sitio se realizaron fotografías hemisféricas sobre el ápice de las plantas utilizadas en las mediciones (n = 10 – 12). El tratamiento de las imágenes con el programa Hemiview 2.1 permitió calcular las proporciones de luz difusa, directa y total del lugar donde se había tomado cada fotografía, así como el número y la duración de los momentos en que había luz directa a lo largo del día (“sunflecks”).
Relaciones hídricas
El estado hídrico de los brinzales se evaluó a través de la medida del potencial hídrico foliar. Se midió con una cámara de presión (PMS Instrument Co. 7000, Corvallis Oregon, USA) en una hoja por planta, y cinco plantas por especie y sitio, en torno al alba (Ψpd) y al mediodía (Ψmd).
Se realizaron además curvas Presión-Volumen en cinco plantas por especie y sitio. En primer lugar las hojas se rehidrataron por inmersión del pecíolo en agua destilada durante varias horas. Posteriormente se dejaban deshidratar en las bancadas del laboratorio, midiendo su potencial hídrico a intervalos de tiempo, representando finalmente la relación entre el contenido hídrico relativo (CHR) y el inverso del potencial hídrico (Robichaux et al. 1984). Cada curva contenía entre 10 y 17 puntos. El contenido hídrico relativo se calculó como el cociente de la diferencia entre el peso fresco (PF) y el peso seco de la hoja (PS), y el peso turgente (PT) y el peso seco:
PS PT PS PF CHR − − = .
El peso turgente se estimó a partir de la relación lineal que existe entre el peso fresco y el potencial hídrico en los primeros puntos de la curva. La hoja se metió en una estufa a 65 ºC durante varios días para obtener su peso seco. A partir de la relación entre el
Material y métodos contenido hídrico relativo y el inverso del potencial hídrico se obtuvieron diversos parámetros fisiológicos.
Los potenciales osmóticos a turgencia plena (Ψπ100) y nula (Ψπ0) se calcularon a
partir de la regresión lineal entre el contenido hídrico relativo y el inverso del potencial hídrico una vez que las células entran en estado de plasmolisis (Ψw = Ψπ):
n CHR m⋅ + = Ψ − π 1 .
En el punto de turgencia plena, CHR = 100 %, así que:
) ( 1 100 n m+ − = Ψπ ,
mientras que para calcular Ψπ0 se considera el contenido hídrico relativo en el punto de
plasmolisis (CHRpt): ) ( 1 0 n CHR m⋅ pt + − = Ψπ .
El módulo de elasticidad de las paredes celulares se calculó en los puntos de mayor turgencia (Emax) según Robichaux et al. (1984):
) ( max a p CHR CHR CHR E = ΔΨ ⋅ − .
El módulo de elasticidad depende de la pendiente de la relación lineal entre el contenido hídrico relativo y el potencial de turgencia celular (Ψp = Ψw − Ψπ), y de la diferencia
entre el valor medio del contenido hídrico relativo en los puntos considerados y el contenido hídrico del apoplasto (CHRa), que a su vez resulta de la extrapolación de la
Material y métodos
m n CHRa = .
El contenido de agua del simplasto a plena turgencia respecto al volumen total de agua (CHRs) se obtuvo a partir de la diferencia con el contenido de agua en el apoplasto.
Parámetros bioquímicos
Se determinó la concentración media de clorofila (Cm) y nitrógeno (Nm) en cinco
plantas por especie y sitio por los procedimientos anteriormente expuestos (sección 3.1.4.). El contenido medio de clorofila y nitrógeno por unidad de área foliar (Ca y Na,
respectivamente) se estimó a partir de los valores de SLA. Sólo se realizaron análisis de nitrógeno foliar en 2004.
Intercambio gaseoso
Se utilizaron dos equipos de análisis de gases por infrarrojos. En 2004 las medidas se realizaron con un IRGA-LCA 4 (Analytical Development Corporation, UK) y en 2005 con un IRGA-LCPro (Analytical Development Corporation, UK).
El protocolo de medición también difirió entre los dos años. En 2004, las hojas se sometieron a luz saturante durante cerca de 15 min para inducir la actividad fotosintética (aproximadamente 1300 μmol m-2 s-1 para las plantas del cortafuegos y 900
μmol m-2 s-1 para las del pinar). Tras tomarse tres registros de la asimilación neta (Asat)
y la conductancia estomática (gsat) a concentración de CO2 ambiental (365 ppm), se
reducía la concentración en el aire de entrada a la cámara foliar en tres pasos (300, 200 y 100 ppm), tomándose en cada punto tres registros más de la tasa de asimilación neta. Se estimó la eficiencia de la carboxilación como la pendiente de la variación de la tasa de asimilación neta con respecto a la variación de la concentración intercelular de CO2
(Ci). La temperatura en la cámara foliar durante este proceso se mantuvo en torno a 25
ºC (temperatura foliar: 24 – 30 ºC). Las medidas se hicieron entre las 9:30 y las 11:30 a.m. para evitar oscilaciones excesivas en el déficit hídrico. Se midieron cuatro plantas por especie y sitio en junio, y tres en agosto.
En 2005 se midió la tasa de asimilación neta a distintas intensidades lumínicas. Las hojas se sometían inicialmente a 800 μmol m-2 s-1 durante aproximadamente 15 min
Material y métodos para lograr la apertura de los estomas y la activación de los procesos fotosintéticos. A continuación se subía la intensidad a 1150 μmol m-2 s-1, y a 1600 μmol m-2 s-1 en las plantas del cortafuegos. La luz se disminuía a continuación a 800 μmol m-2 s-1 y por último a 40 μmol m-2 s-1 en cinco pasos (500, 350, 175, 90 y 40), tomándose en cada punto tres registros de la tasa de asimilación neta. La temperatura dentro de la cámara de medición se programó a 23 ºC para conseguir que la temperatura foliar se mantuviera alrededor de 25 ºC. La concentración de CO2 se mantuvo en torno a 365 ppm durante
toda la curva. Se ajustó un modelo cuadrático a los datos con el programa informático Photosyn Assistant 1.1 (Dundee Scientific, UK):
(
)
R K A K PPFD A PPFD A PPFDA sat sat sat −
⋅ ⋅ ⋅ ⋅ φ ⋅ − + ⋅ φ − + ⋅ φ = 2 4 2 ,
que permitió estimar la tasa de asimilación neta a saturación por luz (Asat), el
rendimiento cuántico aparente (φ) y la tasa de respiración (R).
PPFD (μmol m-2s-1) An ( μ mo l m -2 s -1 ) 0 400 800 1200 1600 2000 0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5
Figura 3.2.Ejemplo de una curva de respuesta de
la fotosíntesis (An) a la luz (PPFD) en una planta de melojo en el cortafuegos.
Las estimaciones de φ y R fueron en varios casos incoherentes, debido al “ruido” de la señal del equipo de medida y al escaso número de puntos de la porción lineal inicial de la curva por lo que no se compararon. El parámetro K describe la forma de la curva. Las medidas se hicieron entre las 8:30 y las 11:30 a.m., en cinco plantas por sitio y especie. Se realizó una tercera medición a finales del mes de julio, en la que se midió la tasa de asimilación neta a niveles de irradiación saturantes (1150 y 1600 μmol m-2 s-1, en el pinar y en el cortafuegos, respectivamente).
Material y métodos
A partir de los valores de transpiración a saturación por luz (Esat) y de potencial
hídrico se estimó la conductancia hidráulica foliar aparente a través del continuo suelo- atmósfera (KL) (Saito et al. 2003): md pd sat L E K Ψ − Ψ = .
Eficiencia en el uso del agua
Los cocientes entre la fotosíntesis neta y la tasa de transpiración, o la conductancia estomática, son indicadores de la eficiencia foliar instantánea en el uso del agua, al reflejar el agua que se pierde por transpiración para la asimilación de un mol de CO2. La
composición isotópica del carbono de un tejido vegetal (δ13C) es un indicador más
integrado de la eficiencia de la asimilación respecto al coste en consumo de agua que los anteriores, ya que refleja la relación entre ambos procesos a lo largo de un periodo de tiempo más amplio. Brevemente, las plantas discriminan positivamente el isótopo
12C respecto al 13C en los procesos de fijación del CO
2. Esta discriminación se reduce
cuando la concentración intercelular de CO2 disminuye –por ejemplo debido al cierre
temporal de los estomas ante situaciones de estrés hídrico o al aumento de la concentración de nutrientes y la tasa de fotosíntesis en hojas bien fertilizadas –, lo que causa el incremento de la abundancia relativa del isótopo 13C en los tejidos (Farquhar et al. 1989). δ13C se calcula como la relación 13C/12C respecto a la de la bentonita usada como patrón. Por ello, valores más altos de δ13C (menos negativos) indican una
eficiencia en el uso del agua mayor.
En el año 2005, las hojas empleadas para medir el intercambio gaseoso se secaron a 65 ºC durante tres días para determinar su valor de δ13C con un espectrómetro de masa
del Servicio Interdepartamental de Investigación (SIDI) de la Universidad Autónoma de Madrid. El método analítico tenía una precisión de ± 0,2 ‰.
Fluorescencia de la clorofila a
Se midió con un fluorómetro portátil de pulso modulado (FMS 2, Hansatech Instruments LTD., UK).
Material y métodos En 2004 se realizaron curvas rápidas de respuesta de la fluorescencia de la clorofila a la intensidad de luz siguiendo un protocolo similar al expuesto en la sección 3.1.3. Las mediciones se hicieron in situ en hojas no escindidas previamente aclimatadas a oscuridad durante aproximadamente 30 min. El equipo se programó para obtener el parámetro Fv/Fm en oscuridad y aumentar a continuación la intensidad de luz
hasta 1500 μmol m-2 s-1 en diez niveles. Antes de pasar al siguiente nivel de intensidad,
las hojas se sometían a un pulso de luz saturante (6600 μmol m-2 s-1 durante 0,8 s) y a
continuación a un pulso de luz del espectro rojo-lejano, lo que permitió estimar en cada nivel la eficiencia fotoquímica efectiva (ΦPSII), la tasa de transporte electrónico (ETR),
la disipación no-fotoquímica de la luz absorbida (NPQ), la disipación fotoquímica (qP) y la eficiencia de los centros de reacción oxidados (Fv’/Fm’):
. ' ' ' ' / ' m o m m v F F F F F = −
El tiempo de exposición a cada intensidad disminuyó entre 4 min en el primer nivel y 30 s en el último, según el tiempo necesario para la estabilización de la señal de fluorescencia observado en ensayos previos realizados en el laboratorio. No obstante se puede afirmar que las curvas no se realizaron en condiciones de aclimatación foliar a la luz debido al retardo de la inducción fotosintética tras la iluminación de las hojas, en concreto de la apertura estomática, que reduce la disponibilidad de CO2 (Ernstsen et al.
1997), y hace que la señal de fluorescencia máxima (Fm) se infravalore en cada punto de
la curva (White & Critchley 1999).
Análisis estadístico
Se realizaron análisis de la varianza (procedimiento GLM) para examinar el efecto del sitio de plantación, la especie y la fecha sobre las variables. Las posibles diferencias en el grado de estrés hídrico entre especies y sitios se controlaron considerando el potencial hídrico al amanecer (Ψpd) como covariable. Se examinaron las interacciones de segundo
orden entre factores. Cuando el término de interacción fue significativo (P-valor < 0,05), se fijó uno de los factores y se realizaron análisis de dos vías para cada uno de sus niveles, o de una vía cuando fue posible agrupar los valores de los otros dos factores (P-
Material y métodos
valor de la interacción > 0,05). Las diferencias entre las medias de cada nivel se compararon a posteriori con el test de Tukey cuando existió un efecto significativo del factor. No se siguió un análisis de medidas repetidas ya que las mediciones de la mayoría de variables no se pudieron repetir sobre las mismas plantas; sólo en el caso de la humedad del suelo se empleó una aproximación de medidas repetidas. Se corrigió la ausencia de normalidad y homocedasticidad transformando el apuntamiento y la kurtosis de los datos con operadores matemáticos.
La intensidad y significación de las relaciones entre variables se determinaron usando coeficientes de correlación de Pearson, ajustándose después los modelos de regresión lineal que recogían mayor porcentaje de variabilidad. La aclimatación de los parámetros foliares al rango de luz generado entre ambientes en cada especie se comparó mediante modelos lineales generales con GSF como variable cuantitativa (covariable), ajustándose modelos distintos para cada fecha si las interacciones con GSF eran significativas. Se emplearon modelos de regresión múltiple para analizar la relación de algunas variables (Ψπ100 y Emax) con la luz (GSF) y el estrés hídrico (Ψpd);
las variables explicativas se introdujeron en el modelo “hacia delante” (forward selection method), según la mejora en la predicción de la respuesta con respecto a un modelo de regresión lineal simple. La evolución de los parámetros de fluorescencia en respuesta al aumento gradual de la intensidad se describió por medio de funciones no lineales. Para ello se proporcionan estimaciones iniciales de los parámetros independientes del modelo hasta que por un procedimiento de iteración se alcanzan los valores que minimizan la suma de cuadrados residual con respecto a los datos medidos; se usó el programa estadístico Statgraphics plus 4.1 (Statistical Graphics Corp.).
La mayor parte de los análisis se presentan anexos a la memoria (anexos IV a VI).
- Tercera plantación (anexo V)
En marzo de 2004, se plantaron 60 brinzales de una savia por especie en los mismos ambientes, repartidos en dos bloques de 30 individuos situados entre los bloques de la plantación anterior. Se plantaron con cepellón y se rodearon con un protector de alambre rígido desde el comienzo para evitar daños por herbívoros.
A finales de 2004 y 2005 se evaluó el desarrollo de los brinzales, excavando el sistema radical de seis plantas por especie en el cortafuegos y la zona de pinar no
Material y métodos aclarada. Se realizó un hoyo de unos 80 cm de profundidad y 30 cm de radio alrededor de la planta. Las plantas extraídas se metieron en bolsas y se llevaron al laboratorio, donde se lavaron y posteriormente se metieron en estufas durante aproximadamente una semana. Se midió la biomasa de raíces (RDM) y la biomasa total de la planta (TDM), calculando la fracción en raíces (RMF) y la proporción de biomasa subterránea respecto a la aérea (R/S). En 2005 se midió también el área foliar total (SFT).
Se realizaron análisis de la varianza en cada año (procedimiento GLM), para evaluar la significación estadística del sitio de plantación y la especie. El modelo de varianza incluyó un término para el efecto del bloque, y otro para la interacción de segundo orden entre el sitio y la especie. TDM se incluyó como covariable en los análisis (anexo V).