naturaleza: líneas celulares de hepatocitos humanos (HepG2) y de neuroblastoma (SK‐N‐MC), mitocondrias aisladas de tejido de corazón de rata, y fracción secretada y fracción citosólica de células T Jurkat en cultivo. Se analizó la eficiencia de la digestión calculando la proporción de péptidos identificados que contenían uno o más sitios de corte, obteniéndose menos de un 10% de digestión parcial en todos los proteomas analizados, incluyendo algunos ricos en proteínas de membrana, lo que demostró la buena reproducibilidad del método (Tabla 1). Este resultado coincide con los obtenidos en los ensayos previos al comparar los distintos métodos de digestión tríptica, descritos en este capítulo, donde la digestión en solución resultó ser el método menos eficiente y se obtuvo el mejor resultado de digestión completa con el método modificado de digestión en gel concentrador. Además, coincide con el resultado obtenido en un trabajo anterior del análisis del
microesferas de tripsina inmovilizada se eliminaron por filtración y se añadió TLCK para inhibir algún posible residuo de actividad enzimática. A continuación, se mezclaron las dos muestras, se desalaron a pH 3.0 y se procedió al fraccionamiento de los péptidos en solución por isoelectroenfoque (IEF) en 24 fracciones, usando el sistema de OffGel. Finalmente, los pares de péptidos 16O/18O de cada fracción de OffGel se analizaron por espectrometría de masas en una trampa iónica lineal. El análisis de identificación de los péptidos dio como resultado una redundancia peptídica del fraccionamiento de péptidos, definida como el ratio de péptidos identificados en fracciones consecutivas en función del número de péptidos únicos identificados en total, menor de 2. Más del 65% de los péptidos identificados se encontraron en una única fracción y más del 75% en una o dos fracciones.
2.3. Efecto de la digestión parcial en la varianza a nivel de péptido
Para evaluar las fuentes de variabilidad del nuevo método se aplicó nuevamente el modelo estadístico para la cuantificación de 18O en trampa lineal previamente descrito [145]. La proporción de valores atípicos a nivel de espectro fue despreciable (en general, no más de 3 valores atípicos en un total de 1300 espectros cuantificados). Además, las varianzas calculadas a nivel de espectro fueron muy similares en todos los proteomas analizados y similares a los obtenidos en un estudio anterior del análisis del proteoma de células HUVEC [117] (datos no mostrados). En cuanto a la varianza a nivel de proteína, no fue significativamente diferente a cero en ninguno de los proteomas analizados (datos no mostrados), indicando que los distintos cultivos celulares y subproteomas fraccionados utilizados en el estudio se procesaron de forma que no introdujeron ninguna fuente de error apreciable que afectara a la comparación relativa de los niveles de proteína. El análisis de la varianza a nivel de péptido es el parámetro más importante para evaluar la idoneidad del método propuesto, ya que esta varianza depende fundamentalmente del procesamiento de la muestra en la etapa de digestión y el posterior marcaje de los péptidos con 18O. Las varianzas calculadas a este nivel fueron muy similares en todos los proteomas estudiados y esencialmente idénticas a los obtenidas con el método de digestión en solución y posterior marcaje [117] (Tabla 1).
Las cuantificaciones de péptidos digeridos que contenían sitios de corte no procesados por la tripsina (Figura 9, puntos negros) o la de los “subpéptidos” correspondientes (cuya secuencia pertenece a la de un péptido no digerido completamente en el mismo experimento) completamente digeridos (Figura 9, puntos blancos) no mostraron una desviación apreciable del resto de los péptidos, indicando que, en todos los casos, la digestión fue reproducible en las dos muestras que se compararon. Se obtuvieron resultados similares en todos los proteomas analizados, listados en la Tabla 1. En coherencia con estos resultados, los valores atípicos a nivel de péptido presentaban un log2‐ratio desplazado de la media de la proteína de forma significativa. A juzgar por el análisis del parámetro FDRp [148] (ver Materiales y Métodos), el número de valores atípicos a nivel de péptido fue
1
Porcentaje de péptidos conteniendo uno o más sitios de corte de tripsina en el interior de la secuencia no flanqueados por residuos de prolina
2
HUVEC, células endoteliales humanas vasculares de cordón umbilical.
Tabla 1. Eficiencias de digestión y varianzas calculadas a nivel de péptido,
obtenidas en los análisis cuantitativos de marcaje con 18O de varios proteomas usando el protocolo propuesto. Proteomas % digestión parcial1 Varianza de péptido (σ2P) (95% C.I.) HepG2 (1) 5.3 0.024 (0.019 - 0.031) HepG2 (2) 4.2 0.018 (0.015 - 0.021) SK-N-MC (1) 2.8 0.018 (0.007 - 0.026) SK-N-MC (2) 4.6 0.019 (0.015 - 0.021) Secretoma 6.7 0.023 (0.014 - 0.029) Mitocondria de Rata 8 0.031 (0.020 - 0.040) HUVEC2 12.9-39.8 0.014-0.021
varianzas estimadas (valores de Zq) y ajustando la curva a la función de Gauss, la desviación estándar de la curva no fue, en ningún caso, significativamente diferente de uno, según lo esperado (Figura 10). Además, no se detectó desviación de la normalidad en ninguno de los proteomas estudiados (Figura 10, recuadro). Por lo tanto, los errores producidos por el método propuesto fueron reproducibles, bien controlados y de acuerdo con la hipótesis nula del modelo estadístico utilizado.
2.4. Aplicación del nuevo método de gel concentrador al estudio
de la activación de las células T Jurkat
Para determinar el rango dinámico de cuantificación y, al mismo tiempo, demostrar la utilidad y fiabilidad del nuevo método de digestión y cuantificación para detectar los cambios de expresión de proteínas dentro de un contexto fisiológico, hemos utilizado como modelo extractos de proteínas del citosol de células T Jurkat control y estimuladas con PMA y Ionomicina. Esta parte del trabajo ha sido desarrollada en colaboración con la Dra. Elena Bonzón Kulichenko. Los extractos de proteínas fueron digeridos con el nuevo protocolo de digestión en gel concentrador y los péptidos resultantes de las células control y activadas se marcaron con 16O y 18O, respectivamente [148]. Las dos muestras se mezclaron entonces en siete proporciones diferentes (1:1, 2:1, 4:1, 8:1, 1:2, 1:4, 1:8; 16O:18O), se fraccionaron por IEF y se analizaron por LC‐MS/MS, de forma que los resultados cuantitativos de estos siete experimentos independientes se podrían comparar en términos de la varianza y la significación estadística de los cambios de expresión.
En cada experimento la “gran media” (X) se calculó como la media ponderada de los cocientes de los log2‐ratios de todas las proteínas cuantificadas [117]. Cuando se compararon las
estimaciones de la “gran media” con los valores esperados, se obtuvieron unos resultados correctos en todos los experimentos, a excepción de una ligera subestimación del valor esperado en el experimento de la proporción 8:1 (Figura 11A). Este efecto era el esperado, ya que en esta proporción las envolturas isotópicas de los péptidos marcados con 16O interfieren significativamente con sus homólogos marcados con 18O, disminuyendo la precisión de los ratios estimados. Sin embargo, en todos los casos hubo un ajuste con las curvas esperadas para una distribución normal