PORCENTAJE DE DEGRANULACIÓN DE BASÓFILOS EN CADA UNO DE LOS GRUPOS DE ESTUDIO

Posteriormente se realizó un análisis en individuos sanos, Grupo I, Grupo II y Grupo III, para establecer si hay diferencia en el porcentaje de degranulación de basófilos en cada uno de estos grupos con respecto al grupo de individuos sanos, a pesar de haber restado el ruido de fondo observamos porcentajes de degranulación tanto en individuos sanos como en pacientes lo que nos permitió hacer la respectiva comparación entre la población de estudio, esto se realizó utilizando las dos concentraciones de extracto de cuerpo completo de pulga (20 y 40 µg).

En la tabla 4 se encuentran las mediana y los rangos de los porcentajes de degranulación de basófilos retados a una concentración de 20 μg de extracto de cuerpo completo de pulga en cada uno de los grupos de estudio.

Tabla 4. Mediana Rango Sanos 8,55% 1-22% Grupo I 1,75% 0-8% Grupo II 7,00% 0-60% Grupo III 23,28% 9-60%

Al comparar los individuos sanos con el grupo I no se encontró diferencia significativa (p= 0.653); individuos sanos con el grupo II tampoco se encontró

diferencia significativa (p= 0.9433), de igual forma que al comparar los individuos sanos con el grupo III no se encontró diferencia (p= 0.0932) (Fig.11 A)

En la tabla 5 se observan las medianas y los rangos de los porcentajes de degranulación de basófilos retados a una concentración de 40μg de extracto de cuerpo completo de pulga.

Tabla 5. Mediana Rango Sanos 9,37% 3-25% Grupo I 2,40% 2-13% Grupo II 7,70% 5-70% Grupo III 19,91% 20-71%

Al comparar el grupo de individuos sanos con el grupo I hay una diferencia significativa de (* p= 0.0295), cuando estos se compararon con el grupo II la diferencia no fue significativa (p= 0.9433), mientras que la comparación de los individuos sanos con respecto al grupo III si fue significativa (**p= 0.0031) (Fig. 11 B).

Figura. 11 Comparación porcentaje de degranulación de basófilos retados a diferentes concentraciones del extracto de cuerpo completo de pulga entre

individuos sanos y los pacientes distribuidos en tiempos de evolución. A.

Comparación porcentajes de degranulación a una concentración de 20 μg de extracto de cuerpo completo de pulga, B. Comparación del porcentaje de degranulación de basófilos a una concentración de 40 ug del alergeno. Se utilizó la prueba no paramétrica “U Mann Whitney”.

7. DISCUSIÓN

La UPPP es una causa común y frecuente de las consultas en pediatría dado que en nuestro medio prevalece la presencia de este ectoparásito, es por esta razón que el estudio de los mecanismos inmunológicos de esta enfermedad cobra tanta importancia ya que se ha visto que involucra componentes tanto humorales como celulares de la respuesta inmune, además de estar influenciada por otros factores. (Revisado por: García, 2004).

En general las enfermedades alérgicas suelen desarrollarse como respuesta de diferentes factores entre los que se encuentra el factor genético, los pacientes con rinitis alérgica, asma o dermatitis atópica frecuentemente tienen familiares con historia clínica de enfermedad atópica (Halken, 2004; Tofte, 2007).

En la UPPP se ha observado al evaluar las historias clínicas que algunos de los pacientes presentan una serie de antecedentes familiares los cuales pueden estar relacionados con el estado atópico de los pacientes. En un estudio realizado por nuestro grupo de investigación se reportó que el 78% de los pacientes presentaban antecedentes familiares de enfermedades atópicas. En este estudio se observó que el 47% de los pacientes incluidos presentaban antecedentes familiares de enfermedades atópicas, aunque este porcentaje representa menos de la mitad de la población es un valor significativo con el que se demuestra un comportamiento similar con respecto a lo reportado en dicho estudio acerca del estado atópico que presentan algunos pacientes con UPPP (Cuellar, 2009).

Adicionalmente se ha observado en diferentes estudios realizados por nuestro grupo de investigación que la mayoría de los pacientes con UPPP son del género masculino, siendo este otro factor que puede llegar a estar involucrado con el

desarrollo de esta enfermedad, en este trabajo se encontró que de igual forma la mayoría de la pacientes eran niños (73%), comparado con un 23% de pacientes niñas.

Hasta hace poco tiempo los basófilos no se tenían en cuenta en estos estudios, debido principalmente a la poca cantidad que se encuentra en sangre periférica. Como se había mencionado anteriormente, esto representaba un problema para los diferentes estudios de los mecanismos inmunológicos en los que están involucrados los basófilos tanto in vivo, como in vitro; sin embargo, se ha visto que estas células juegan un papel fundamental en las reacciones alérgicas inmediatas, por lo tanto, los estudios se han concentrado en el análisis de los basófilos circulantes, para así poder entender los mecanismos que desencadenan estas enfermedades (Revisado por: Boumiza, 2005).

Gracias a la técnica utilizada, se pudo recuperar un buen número de basófilos para analizar tanto en las muestras de individuos sanos como en las muestras de los pacientes, además observamos que no se encontró diferencia en la proporción de células identificadas con los marcadores que corresponden a basófilos IgE positiva entre pacientes con UPPP e individuos sanos.

En diferentes estudios en los que se han utilizado las pruebas de activación de basófilos, el umbral de positividad se determinó con el uso del control negativo. Por lo tanto los resultados se consideraron positivos cuando se observaba que la expresión del marcador CD63 era mayor aproximadamente en un 10% más con respecto a los valores del control negativo. Este tipo de protocolos ha sido validado para alergenos comunes por varios grupos de investigación (Revisado por: Ebo, 2005).

En este trabajo se encontró que los porcentajes de degranulación de basófilos retados a diferentes concentraciones del extracto de cuerpo completo de pulga eran mayores con respecto al control negativo en pacientes del grupo III e individuos sanos, observando un patrón de degranulación similar.

También se observó que la IgE específica para los antígenos de pulga está involucrada en el proceso degranulación de los basófilos, ya que se observó una mayor actividad en los basófilos que fijaban IgE en su superficie, sin embargo, los comportamientos variaron dependiendo del grupo de estudio, encontrándose que en los individuos sanos y los pacientes con más de cinco años de evolución de la enfermedad presentan un mayor porcentaje de degranulación de basófilos, mientras que los pacientes con menos de dos años de evolución de la enfermedad presentaron valores de degranulación muy bajos, esto se puede correlacionar con el estudio realizado en el 2004 en el que se demostró que los pacientes con mas tiempo de evolución de la enfermedad reconocen un grupo de proteínas del extracto de pulga por IgE indicando que la dinámica de los anticuerpos puede estar determinada por el tiempo de evolución.

En las enfermedades alérgicas la concentración del alergeno es un factor que predispone al desarrollo de enfermedades alérgicas en general ya que suelen depender de la dosis del alergeno (Sokol, 2008; Valenta, 2004). Los resultados de este trabajo mostraron que a una concentración de 40 μg hubo una mayor actividad en la degranulación de los basófilos inducida por la IgE específica comparada con la actividad de estas células reatadas a una concentración de 20 μg.

Adicionalmente, el reconocimiento de los alergenos por parte de la IgE especifica puede estar relacionando con la avidez de los anticuerpos, ya que se ha mostrado que a medida que pasa el tiempo y hay mas exposiciones al alergeno aumenta la avidez de los anticuerpos (Mitchell, 2002).

A partir de estos resultados se debe seguir teniendo en cuenta que la concentración de la IgE en suero es un factor que puede llegar a ser determinante en el desarrollo de la enfermedad; estudios realizados en basófilos han demostrado que la interacción de la IgE con el receptor FcεRI favorece la expresión de este último, de modo que existe una correlación entre los niveles de expresión del receptor y la concentración de IgE en suero. Una alta concentración de IgE favorece la expresión del receptor, pero en su ausencia estos niveles disminuyen (Revisado por: Saini, 2002). Esto puede explicar por que los pacientes del grupo I presenten menor porcentaje de degranulación incluso con respecto al grupo de individuos sanos y los grupos II y III.

A pesar que es muy complejo entender los mecanismos inmunológicos de esta enfermedad, con este estudio se observó que la IgE tiene una actividad funcional significativa frente a los antigenos de la pulga, en donde juega un papel fundamental para la activación de células como los basófilos, ya que induce la degranulación liberando los mediadores preformados tanto en pacientes como en individuos sanos, mientras que en ausencia de esta molécula esta actividad celular no se presenta; además con respecto a la literatura se puede pensar que la actividad de la IgE depende de factores tales como la concentración de la IgE y la avidez de este tipo de anticuerpos.

8. CONCLUSIONES

- No se encontró diferencia en el porcentaje de basófilos que fijan IgE en su superficie entre pacientes con UPPP e individuos sanos

- La actividad de la IgE específica para los antígenos de pulga tiene un comportamiento similar en individuos sanos y pacientes con más de cinco años de evolución de la enfermedad.

- La degranulación de basófilos mediada por IgE especifica es mayor frente a una concentración de 40 μg de extracto de cuerpo completo de pulga

- El 47% de los pacientes con UPPP presentan antecedentes familiares de enfermedades atópicas

9. RECOMENDACIONES

- Es importante realizar la cuantificación de la IgE específica para los antigenos de la pulga, lo cual podría permitir entender porque varía el porcentaje de degranulación de los basófilos según el tiempo de evolución con respecto a los individuos sanos. También es importante establecer si el reconocimiento de las proteínas tiene que ver ya sea con la concentración del alergeno o con la avidez de la inmunoglobulina.

- Continuar este estudio teniendo en cuenta no solo el tiempo de evolución de la enfermedad, sino también la edad de los individuos incluidos en el estudio, ya que la mayoría de los individuos sanos eran mayores de cinco años de edad y estos presentaron porcentajes de degranulación importantes, de igual forma que ocurrió con los pacientes del Grupo III, los cuales presentaron los mayores porcentajes de degranulación de basófilos, estos pacientes también presentabas mas de 5 años de edad y mas de 5 años de evolución de la enfermedad. Adicionalmente, al comparar las medianas de las edades de los individuos sanos con los pacientes del grupo III no se encontró una diferencia significativa. Para esto se pueden incluir individuos sanos con menos de 5 años de edad.

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11. ANEXOS

ANEXO 1

CONSENTIMIENTO INFORMADO (Muestras de pacientes)

TÍTULO DEL PROYECTO: Actividad funcional de la IgE específica en pacientes

con urticaria papular por picadura de pulga

INVESTIGADORES: Elizabeth Garcia, Evelyne Halpert, Adriana Cuéllar, Adriana

Rodríguez, John Mario González. Facultad de Medicina Universidad de los Andes y Fundación Santa Fe de Bogotá.

El siguiente es un documento informativo a cerca de la participación de su hijo o hija en un protocolo de estudio para determinar la presencia de ciertos marcadores en la enfermedad denominada urticaria papular. La participación en el estudio es voluntaria y no representa mayor riesgo para los individuos que en el participan. Los resultados del estudio no son divulgados con nombres propios y ellos no tienen influencia en el diagnóstico, tratamiento y pronóstico de la enfermedad,

Es importante que usted lea y entienda cuidadosamente el contenido de este documento. El documento se refiere a lo que usted necesita saber sobre el estudio. Si usted decide que su hijo o su representado participen en este estudio, debe firmar este consentimiento informado. Su firma quiere decir que se le ha explicado y entendido en que consiste el estudio y sus posibles riesgos. Este estudio es una investigación descriptiva que se realizará conjuntamente con profesionales de la Fundación Santa Fe de Bogotá, la Facultad de Medicina de la Universidad de los Andes y la Facultad de Ciencias de la Pontificia Universidad Javeriana. Este estudio antes de ser realizado cuenta con el aval y la aprobación de los comités de Ética de la Fundación Santa Fe de Bogotá y la Pontificia Universidad Javeriana.

El objeto del estudio, es determinar el tipo de respuesta inmunológica (defensa) en sangre que refleje lo causado en piel por la picadura de pulga. Esta enfermedad es muy frecuente en nuestro medio y hasta el momento no se conoce acerca de cómo se produce y en consecuencia no existe un tratamiento efectivo. Con este conocimiento avanzaremos en los posibles mecanismos que están involucrados en su producción que posiblemente podrían resultar en nuevas aproximaciones para su tratamiento.

De su hijo (a) se obtendrá una muestra de sangre obtenida por punción venosa a nivel del antebrazo. La punción será realizada por una persona entrenada, con material desechable y adecuadas condiciones de limpieza. También se le

harán algunas preguntas para completar un cuestionario. La muestra se sangre será marcada con un código especial del estudio. La punción venosa representa un riego muy bajo y como única consecuencia podría resultar un pequeño hematoma (morado) en el sitio donde penetra la aguja. Usted puede decidir que su hijo o apoderado no participe en la investigación si no lo desea, y esta decisión no perjudicará la relación con el médico tratante, quien continuará con el tratamiento pertinente. No habrá ningún costo adicional para usted por permitir la participación de su hijo o apoderado en el estudio. Por favor marque una de las siguientes:

____ Si autorizo la toma de muestra y la participación en el estudio. ____ No autorizo la toma de muestra y la participación en el estudio.

La muestra que se esta obteniendo de su hijo (a) puede servir para obtener otros componentes de la sangre (ejemplo suero) que pueden ser almacenados y utilizados en proyectos similares. Como estas muestras son valiosas usted pude autorizar o no que se usen en estudios futuros. Por favor marque una opción: ____ Si deseo que la muestra sea almacenada en anonimato para otros estudios.

____ No deseo que la muestra sea almacenada para futuros estudios.

En el caso de que el médico tratante considere que usted pueda beneficiarse con la vacuna que actualmente este disponible para el tratamiento del la urticaria papular se le suministrara está vacuna sin costo adicional.

Los datos de este estudio serán publicados. El nombre o cualquier forma de identificación, no serán utilizados sin su expresa autorización. La historia clínica de su hijo o apoderado podrá ser utilizada por el investigador para el estudio. Me ha sido dada la oportunidad de hacer todas las preguntas y estas han sido respondidas. Me han dado una copia de este consentimiento informado.

Usted puede hablar con los investigadores en cualquier momento y hacer cualquier pregunta que tenga en relación con el estudio.

Los investigadores: la Doctora Elizabeth García y la Doctora Evelyne Halpert, las