cada litro de cultivo.
(%) Cationes Monovalentes
5. Caracterización estructural de la Dp NDT recombinante
5.8. Predicción del centro activo de la Dp NDT recombinante
Con el fin de dilucidar el centro activo de la DpNDT recombinante se llevó a cabo un
alineamiento de la estructuras primaria de la DpNDT con otras nucleósido 2’-
desoxirribosiltransferasas descritas (Figura 34) (Apartado 16.4 de Materiales y Métodos).
LhNDT1 ---MNKK-KTLYFGAGWFNEKQNKAYKEAMAALKENPTVDLENSYVPLENQYKGI 51 LhNDT2 ---MNKK-KTLYFGAGWFNEKQNKAYKEAMAALKENPTVDLENSYVPLENQYKGI 51 LlNDT ---MP-K-KTIYFGAGWFTDRQNKAYKEAMEALKENPTIDLENSYVPLDNQYKGI 50 LrNDT ---MINQKSKTVYFCAGWFTDKQNKAYEDAMNAIKANPTVDVENSYVPLQHQYKGL 53 LhPTD ----MKAVVPTG--KIYLGSPFYSDAQRERAAKAKELLAKNPSIAHV--FFPFDDGFTDP 52 LfNDT ----MKNDTPVANTKIYLATSFFNEEQRARIPQALAQLEANPTVGVV--HQPFDFQYKDA 54 Lc.lNDT ---MNKLFNQAVNVYLAAPFFSESQIKKVELLENALSKN--KTVANFFSPMRCQHPE- 53 DpNDT ---MDNLSFR-PKLYLAAPLFNEAEKESNRNIRDSLIDCCDVFLP---QEDGL 46 .:*: : : LhNDT1 RIDEHPE-YLHNIEWASATYHNDLVGIKTSDVMLGVYLPEEED--VGLGMELGYALSQGK 108 LhNDT2 RIDEHPQ-YLHNIEWASATYHNDLVGIKTSDVLLGVYLPQEEH--VGLGMELGYPLSQGK 108 LlNDT RVDEHPE-YLHDKVWATATYNNDLNGIKTNDIMLGVYIPDEED--VGLGMELGYALSQGK 107 LrNDT RVDEHPE-LLQDREWSTATYNGDRVGVSTSDMLLAVYIPEEED--VGMGVELGMARALGK 110 LhPTD DEKNPEIGGIRSMVWRDATYQNDLTGISNATCGVFLYDMDQLD--DGSAFEIGFMRAMHK 110 LfNDT RVDSDPAGVFGSLEWQIATYNNDLNAVGTSDVCVALYDMDQID--EGICMEIGMFVALHK 112 Lc.lNDT SLPQEVEAFTP--EWAKATMENDVNEVNKADIIVAIVDFDHQDTDSGTAWELGYAIALEK 110 DpNDT LLDELVSLGTPLKVAEKSIYEADISAMKNADILLAVLDGACID--DGVAFELGYAKAINK 104 . : : : . * *:* : * LhNDT1 YILLVIPDE--DYGKPINLMSWG----VCDNASKISELKDFDFNKPRYN-FYDGAVY- 158 LhNDT2 LFFWFSHMK--DYGKPIILMSWG----VCDNASQISELKDFDFNKPRYN-FYDGAVY- 158 LlNDT YVLLVIPDE--DYGKPINLMSWG----VSDNVIKMSQLKDFNFNKPRFD-FYEGAVY- 157 LrNDT YIMVVIPDE--DFGKPINLMSWG----IADNFIKMSELPNYDFNKPSYN-FYDGGVY- 160 LhPTD PVILVPFTEHPEKEKKMNLMIAQGVTTIIDGNTEFEKLADYNFNECPSNPVRGYGIY- 167 LfNDT PIVLLPFTKKDKSAYEANLMLARGVTTWLEPN-DFSPLKDFNFNHPMAQPFPPFKVF- 168 Lc.lNDT PTYLIRFEDT----IPANIMLTER---NRAFFTQIEQVEEYDFLESKLIPYSGKYQ-- 159 DpNDT VCLGFQTDVRRQAPTGNNPMIECS---CEEIFSDLGSLK--KWLQQKYNKLS--- 151
. : . .
Figura 34: Alineamiento de las diferentes secuencias de aminoácidos de 2’-desoxirribosiltransferasas de
Lactobacillus utilizando el programa CLUSTALW2. LhNDT1Lactobacillus helveticus CNRZ32 (Código de
acceso GeneBank gi 20336339); LhNDT2, Lactobacillus helveticus ATCC 8018 (gi 9279801), LlNDT, Lactobacillus leichmannii (PDB:1F8Y); LrNDT, Lactobacillus reuteri CECT 925 (gi 5188639); LhPDT Lactobacillus helveticus CNRZ32 (gi 47168984), LfNDT, Lactobacillus fermentum (gi 52000748), Lc.lNDT, Lactococcus lactis subsp lactis (gi 281490987) DpNDT, Desulfothalea psychrophila producida por E. coli BL21(DE3). (*) indica residuos individuales totalmente conservados (:) indica conservación de la naturaleza
aminoácidos implicados en el centro activo de NDT descritas. En el caso de DpNDT corresponde a los
aminoácidos Tyr 11, Gln 42, Asp 69 y 89, Glu 95 y Asn 122 (N).
Como se puede observar, la DpNDT recombinante no muestra elevada identidad con
las otras 2´-desoxirribosiltransferasas descritas (Figura 34), si bien se puede apreciar una elevada similitud estructural (Apartado 5.7 Resultados y Discusión). Analizando con detalle la secuencia de aminoácidos, se observa que la DpNDT presenta conservados
aquellos aminoácidos descritos como parte del centro activo de las 2´- desoxirribosiltransferasas (Kaminski, 2002; Porter y col., 1995a; Porter y Short, 1995a;
Short y col., 1996) (indicados en amarillo). En el caso de la NDT de Lactobacillus leichmannii, los residuos Tyr 7, Asp71, Asp 91, Glu 98 y Asn 122 intervienen en el
reconocimiento de la 2´-desoxirribosa siendo el Glu 98 el resíduo determinante de la actividad catalítica (Kaminski, 2002; Porter y col., 1995a; Porter y Short, 1995a; Short y col., 1996), mientras que los residuos Glu 45, Asp 71 y Tyr 157 participan en la el
reconocimiento de la base. Como se puede observar en la secuencia de aminoácidos (Figura 34), la DpNDT presenta estos residuos conservados, si bien cabe destacar la
ausencia de Tyr C-terminal. Este hecho podría explicar los bajor valores de actividad que presenta la DpNDT, así como su baja eficacia catalítica (kcat/KM) con respecto a
otras NDTs (Fernández-Lucas y col., 2010; Kaminski, 2002).
Por otro lado, existen algunas diferencias entre las desoxirribosiltransferasas tipo II (NDT) y la desoxirribosiltransferasa tipo I (PDT) de Lactobacillus helveticus. En
concreto, el residuo Tyr 17 (enmarcado en verde en la Figura 34), involucrado en el reconocimiento del grupo hidroxilo del C5´, está reemplazado por fenilalanina en las enzimas NDT. El residuo Ser 14 (en rosa) está reemplazado por un residuo de alanina excepto en el caso de Lactobacillus fermentum donde está reemplazado por treonina
(Kaminski, 2002; Porter y col., 1995a; Porter y Short, 1995a; Short y col., 1996).
En la Figura 35 se muestra una aproximación del posible centro activo de la DpNDT
recombinante, diseñado según la similitud de la secuencia de la misma con la LlNDT, en
el que se muestran los residuos mencionados anteriormente como responsables del mecanismo del centro activo. En la bibliografía está descrito que el centro activo de estas enzimas está formado por los aminoácidos de dos subunidades del homohexámero como es en el caso de la nucleósido 2´-desoxirribosiltransferasa de
tanto, existirían 6 centros activos por homohexámero. En el caso de la DpNDT, al igual
que ocurre en la nucleósido 2´-desoxirribosiltransfera de Lactococcus lactis subsp. lactis, la estructura cuaternaria de la proteína es homotetrámerica, y por tanto, tendría 4
centros activos.
Figura 35: Aproximación del centro activo de la DpNDT en el reconocimiento de la adenina.
Representación gráfica de los aminoácidos de la DpNDT que intervienen en el reconocimiento del sustrato
en este caso adenina: Tyr 11, Gln 42, Asp 69 y 89, Glu 95 y Asn 122. En rojo se muestra el resíduo Tyr 151, añadido mediante mutagéneis dirigida.