Preparación de soluciones 1 Soluciones en presencia de O

Las soluciones de Lum se prepararon disolviendo el sólido en agua libre de iones metálicos. Para favorecer la disolución se agregaron pequeños volúmenes (~ 10 – 100 µl) de NaOH 0,5 – 1 M. Como se mencionó anteriormente, en medio alcalino Lum presenta grupos ionizados, que hacen que su disolución esté más favorecida que en medio ácido. Posteriormente, se llevó a volumen final mediante el uso de matraces y se trasvasó la solución a frascos color caramelo para evitar la exposición a la luz.

Los nucleótidos son muy solubles en agua, por lo tanto, las soluciones se prepararon a pH neutro. Para dGMP (260 _{= 12180 M}-1 _cm-1₎1_{, se compararon valores de}

concentración calculados por pesada o calculados a través del coeficiente de absorción molar y se obtuvieron valores similares, dentro del error experimental. Por lo tanto, se utilizó indistintamente cualquiera de los dos métodos. Por el contrario, en el caso de dAMP, dado que la droga se hidrata fácilmente, la concentración se calculó sólo utilizando la absorbancia de la solución preparada y su coeficiente de absorción molar a 260 nm (260

= 15060 M-1 cm-1).1

El pH de trabajo, al igual que la concentración de las soluciones, dependió básicamente del experimento en el cual serían empleadas. Las concentraciones de ácido y álcali utilizadas para llevar a pH variaron entre 0,1 y 2,0 M. Las soluciones de NaOH de distintas concentraciones se prepararon por pesada. Se empleó NaOH en granallas. Las soluciones resultantes no fueron tituladas, pues esta operación no es necesaria a los fines de este trabajo. Por su parte, se prepararon soluciones de HCl a partir de solución concentrada comercial. Las concentraciones de estas soluciones, fueron similares a las de NaOH y tampoco se titularon para conocer con mayor exactitud su concentración. Las medidas de pH se realizaron en un pH-metro PHM22O (Radiometer Copenhagen) en

combinación con un electrodo de pH pHC2011-8 (Radiometer Analytical). La calibración

del mismo se realizó empleando soluciones amortiguadoras comerciales con valores de pH 4,00; 7,00 y 10,00 (Carlo Erba).

Para los experimentos de fotosensibilización, las mezclas entre soluciones de sensibilizador (Lum) y nucleótido se realizaron de dos formas. En algunos casos se mezclaron soluciones de Lum y nucleótido de igual pH y, en otros casos, se agregó el

Preparación e irradiación de soluciones

nucleótido sólido a una solución de Lum de concentración y pH adecuados para el experimento a realizar. Antes de iniciar cada experimento se controló el pH y el espectro de absorción de la mezcla.

5.2.2 Soluciones en ausencia de O2

Algunos experimentos se realizaron con soluciones libres de O2. Para eliminar

dicho gas se utilizaron celdas de cuarzo de 1cm x 1cm con tapa con cierre hermético, con un tapón de silicona (Figura 5.1). A través del tapón superior, se pincharon dos agujas; actuando, una como vía de entrada y otra como vía de salida. Mediante este dispositivo las soluciones fueron burbujeadas con un gas inerte (Ar o N2) durante, al menos, 20 minutos.

Luego, las aberturas fueron cubiertas con parafilm.

Durante el burbujeo, además de O2, se elimina el CO2 disuelto en la solución. El

CO2 en solución se encuentra en equilibrio con H2CO3, que está parcialmente disociado.

Por lo tanto, al eliminarse el CO2, los equilibrios de las reacciones 1 a 3 se desplazan hacia

la izquierda consumiéndose protones. En consecuencia, la solución se alcaliniza ligeramente. Debido a esto, se registraron los espectros de absorción de las soluciones antes y después de burbujear para controlar que se mantenga la forma ácido-base de Lum deseada para el experimento a realizar.

CO2(g) CO2(aq) (1)

CO2(aq) + H2O H2CO3 (2)

H2CO3 HCO3- + H+ (3)

Por otro lado, los gases inertes están libres de H2O, por lo que el burbujeo de la

solución provoca la pérdida de cierta cantidad de H2O. En consecuencia, burbujeos

prolongados e intensos pueden producir una eliminación apreciable de solvente concentrando la muestra. El control espectral de las soluciones antes y después del burbujeo sirve, además, para detectar cambios en la concentración de la muestra.

5.2.3 Soluciones en agua deuterada

En algunos estudios, especialmente aquellos relacionados con oxígeno singlete (1O2), se utilizó agua deuterada (D2O) en lugar de H2O como solvente. Las soluciones en

Parte II-Capítulo 5

procedimiento permite disminuir el gasto de solvente empleado en los distintos experimentos, que en el caso de D2O, es muy costoso. Debido a la escasa masa empleada,

el sólido no puede pesarse previamente. Por consiguiente, las concentraciones se calcularon midiendo la absorbancia de las soluciones y empleando los correspondientes valores de . Previamente, se controló que los espectros de absorción y los  sean iguales en ambos solventes.

El pD (-log [D+]) fue medido con el mismo pH-metro que el usado para las soluciones en H2O. Los valores de pD se calcularon aplicando la siguiente corrección a

cada medida2:

pD = pH + 0,4 (4)

donde pH es el valor leído en el pH-metro. El pD fue ajustado mediante el agregado de pequeños volúmenes, con micropipeta, de soluciones en D2O relativamente concentradas

de NaOD y DCl.

5.2.4 Soluciones con secuestradores selectivos

Se realizaron experimentos de irradiación continua variando las condiciones experimentales. Un caso particular que merece comentarse brevemente consistió en el agregado de sustancias que modifican la concentración de un estado excitado en particular o de un intermediario de reacción.

Para estudiar la posible participación del anión superóxido (O2•−) en el mecanismo

de las reacciones estudiadas en este trabajo, se irradiaron soluciones en presencia de la enzima superóxido dismutasa (SOD). Esta enzima cataliza la dismutación de O2•− en H2O2

y O2, eliminándolo del medio de reacción:

2 O2•− + 2H+  H2O2 + O2

Se realizaron experimentos de irradiación estacionaria, con y sin enzima (control), y se compararon las velocidades iniciales de reacción. Para la preparación de las soluciones con enzima, se tomó una alícuota de la solución control y se le agregó la masa de enzima requerida para cada experimento particular. Dicha masa, corresponde a una cierta actividad enzimática por unidad de volumen.

Preparación e irradiación de soluciones

La velocidad puede ser la misma, con y sin enzima, si el O2•− no está involucrado

en el proceso. Por el contrario, si el O2•− participa en el proceso, la velocidad se ve afectada

en los experimentos con enzima respecto a los experimentos control.

Algunos iones inorgánicos actúan como desactivadores de estados excitados de moléculas orgánicas, en un fenómeno que se conoce como efecto del átomo pesado.3 En este trabajo, se utilizó el anión yoduro para desactivar estados excitados. Para ello se adicionó yoduro de potasio (KI) a las soluciones a irradiar, y se compararon las velocidades iniciales de consumo de reactivos y formación de productos en presencia y ausencia de dicho anión. La elección de las concentraciones empleadas y el efecto concreto sobre los distintos estados excitados serán discutidos en el Capítulo 9.