PREVALENCIA DE LOS ANA

Para definir la importancia de los ANA en la leishmaniosis canina hemos de conocer su prevalencia. Los trabajos publicados hasta ahora han determinado cifras variables y siempre utilizando técnicas de IFI sobre hígado de rata. Nuestro objetivo ha sido determinar la prevalencia de ANA en perros con leishmaniosis utilizando tanto esta técnica como la técnica de IFI sobre células Hep- 2, y técnicas específicas de antígenos que en general se consideran más sensibles.

Inmunofluorescencia sobre hígado de rata

Empleando esta técnica, 14 de los 60 perros estudiados (23,3%) presentaron un título de ANA positivo. Estos resultados son similares a la prevalencia obtenida en trabajos previos empleando el mismo tipo de substrato. En un estudio anterior llevado a cabo también en el Departamento de Medicina y Cirugía Animal de la Facultad de Veterinaria de Córdoba, se aplicó la misma técnica sobre una muestra más reducida empleando criocortes de hígado de rata como substrato. Se obtuvo una prevalencia de ANA del 15,9%. La muestra estudiada fue relativamente pequeña y en una enfermedad tan variable como la leishmaniosis canina, este hecho puede explicar las diferencias encontradas (Lucena et al., 1996). En un trabajo anterior, 14 de 45 perros con leishmaniosis (31%), presentaron un título positivo de ANA (Slappendel, 1988); mientras que en otro trabajo posterior 28 de 53 perros (52%) mostraron títulos positivos de ANA (Ciaramella et al., 1997).

Resumiendo los resultados anteriores, los ANA se encuentran elevados en un número significativo de perros con leishmaniosis, que podría oscilar en un amplio margen comprendido entre el 23% y el 52% de los perros enfermos. Todos estos trabajos han empleado como substrato criocortes de hígado de rata. De entre todas las técnicas empleadas, la inmunofluorescencia indirecta usando el hígado de rata como substrato ha sido el método tradicional (Fritzler, 1992) y

se considera un método útil para la determinación de ANA en el perro (Bell et al., 1997).

La elección del substrato es uno de los factores técnicos más importantes en las pruebas de IFI (Fritzler, 1992). Los estudios comparando varios substratos han demostrado que son comparables en su capacidad para cuantificar los títulos de anticuerpos (Fritzler, 1992). Sin embargo, algunas encuestas de calidad hechas para varios métodos de IFI en muchos laboratorios americanos, detectaron hasta diferencias del orden de 64x en los títulos de ANA en el mismo suero (McVey y Shuman, 1991). Los factores técnicos que limitan la reproducibilidad inter- e intraensayo son: substrato, carencia de sueros patrón con un título definido para ANA de diferente especificidad, diferencias en la calidad y conformación de las ópticas de los microscopios, distintos conjugados y diferencias de concentración, especificidad y tasas de fluorocromo/proteína (Fritzler, 1992). Estos factores técnicos junto con diferencias poblacionales pueden explicar las variaciones registradas en la prevalencia de ANA.

Muchos de estos problemas pueden solucionarse empleando un título de positividad apropiado para reducir los falsos positivos. En laboratorios de humana se realiza una primera dilución al 1:40 para personas menores de 40 años y de 1:80 para personas mayores de esta edad. También es aconsejable verificar periódicamente la validez del título frente a una batería de sueros sanos, para asegurarnos que hay menos de 5-10% de positivos en esta población de referencia

(Astion et al., 2000). El título definido como positivo debe ser elegido de tal forma que entre el 5-7% de la población clínicamente sana sea positiva (Astion et al., 2000). En nuestro estudio, se utilizó un grupo de 30 perros sanos para comprobar la validez de nuestro título. Ninguno de estos animales obtuvo un título positivo, por lo que la probabilidad de obtener resultados falsos positivos parece muy pequeña, sin embargo es probable que hubiese algún resultado falso negativo. La alta prevalencia citada por Ciaramella et al. (1997) puede deberse a la existencia de resultados de este tipo. Desgraciadamente, estos autores no citan el título que consideran como positivo, siendo este dato la mayor fuente de variación entre laboratorios (Lapras y Monier, 1971). El mayor atractivo de las pruebas de fluorescencia para la titulación de ANA es su simplicidad y su sensibilidad. Sin embargo, se ha demostrado que si no se usan controles adecuados pueden existir grandes variaciones entre laboratorios. En un estudio donde se remitió una serie de sueros a diferentes laboratorios se comprobó que la correlación entre los resultados de la determinación de ANA en gatos no era significativa, mientras que en perros el coeficiente de correlación fue significativo pero con un valor de sólo 0,66 (Troy et al., 1996).

Inmunofluorescencia sobre células Hep-2

Empleando las células Hep-2 como substrato sobre una población de 67 perros con leishmaniosis, el porcentaje de positividad se elevó al 55,23% y se obtuvieron unos títulos relativamente

elevados, alcanzando en 11 perros títulos iguales o superiores a 320 que podemos considerar como clínicamente muy significativos (Figura 7). Células Hep-2 <40 40 80 160 320 640 0 10 20 30 40 Título N ú m e ro d e a n im a le s

Figura 7.- Histograma de la distribución de títulos

positivos en la prueba de IFI sobre células Hep-2.

Existe la opinión generalizada de que al menos deben emplearse dos substratos diferentes antes de considerar una muestra como negativa (Fritzler, 1992). La elección más práctica son los cultivos celulares (por ejemplo células Hep-2), los cuales producen una proporción menor de resultados falsos negativos (Fritzler, 1992). Por otro lado, las células Hep-2 han demostrado ser un substrato mucho

más fiable que los criocortes de hígado de rata para la investigación de ANA en el perro ya que también producen una menor proporción de falsos positivos (Hansson et al., 1996).

En el perro, trabajos previos han demostrado que las reacciones positivas con diluciones bajas eran relativamente frecuentes en perros sanos utilizando como substrato cortes de hígado de rata. Por el contrario, los perros sanos no mostraron reactividad alguna cuando se usaron células Hep-2 como substrato, incluso analizando las muestras a diluciones tan bajas como 1:15 (Hansson et al., 1996). Estos autores concluyeron que las células HEp-2 eran un substrato mucho más apropiado para el perro debido a su baja reactividad con los sueros de perros normales. Otra consideración importante es el alto nivel de correlación (62:63) que encontraron en perros enfermos para ambos substratos.

Un segundo motivo de controversia es decidir a partir de qué título consideramos significativa la presencia de ANA en el contexto de la enfermedad. La importancia de este punto es grande si tenemos en cuenta que títulos positivos de ANA se han identificado en muchas enfermedades tumorales, inflamatorias e infecciosas e incluso en personas sanas (McVey y Shuman, 1991). La determinación de ANA es por tanto una técnica inespecífica (Shull et al., 1983). Otras veces los ANA aparecen meses o años antes de que se desarrolle el cuadro clínico íntegro de la enfermedad autoinmune (Bradwell et al., 1995). La

incidencia de ANA puede aumentar con la edad del paciente (Svec y Veit, 1967). Aproximadamente entre el 30 y el 38% de personas mayores de 60 años tienen títulos significativos de ANA (Litwin y Singer, 1965; Wilson y Sanders, 1992). Parece ser que estas personas tendrían ANA de la clase IgM e IgA pero en ningún caso de la clase IgG (Svec y Veit, 1967). La prevalencia de ANA en perros sanos parece ser mayor en perros de la raza pastor alemán (Chabanne et al., 1995).

En nuestro trabajo se eligió un título de 1:40 como valor de corte. Este título es menor del recomendado por trabajos previos donde se han empleado títulos de corte de 1:100 (Hansson et al., 1996). Como en el apartado anterior, la técnica se aplicó sobre 30 animales sanos sin que hubiera ninguna muestra positiva aplicando un valor de corte de 1:40. Este es también el valor recomendado por el fabricante de los reactivos. A pesar de estas precauciones, más de la mitad de perros con leishmaniosis fueron positivos con el título más bajo, y es probable que alguno de estos resultados constituyan falsos positivos o bien que la leishmaniosis canina induzca títulos no demasiado elevados de ANA.

En conclusión, títulos bajos de anticuerpos antinucleares son relativamente frecuentes en la leishmaniosis canina aunque su prevalencia varía según la técnica empleada. Por su mayor sensibilidad y por permitir la diferenciación de varios patrones de

inmunofluorescencia, la técnica de IFI sobre células Hep-2 es la técnica de elección para la determinación de ANA en perros con leishmaniosis.