CAPÍTULO II: La β-glucanasa eng2 es necesaria para la disolución de la pared del asca durante
3. Procedimientos generales de clonación molecular Vectores de S pombe
de S. pombe
Los plásmidos utilizados en S. pombe poseen una serie de características comunes, como son: un origen de replicación y un marcador de selección bacterianos, una secuencia de replicación autónoma ars y un marcador de selección en levadura (generalmente, se trata de un marcador metabólico). Para la realización de este trabajo se emplearon en repetidas ocasiones los vectores pAL-KS+ o pAU-KS+. Éstos fueron construidos por el Dr. J. Ishiguro (Donan University, Japón) a partir del vector pBluescript II KS+ (Stratagene), al que se le añadió el marcador LEU2 o URA3 de
S. cerevisiae y la secuencia ars1+ de S. pombe.
Contiene los siguientes elementos: - Gen de resistencia a ampicilina (amp). - Origen de replicación relajada colE1 (ori). - Fragmento del operón lactosa de E. coli (lacZ) que codifica el péptido α de la β-galactosidasa. En la región estructural de este gen y manteniendo la fase de lectura abierta se ha insertado un fragmento que incluye sitios de reconocimiento para 11 endonucleasas de restricción.
- Promotores de las ARN polimerasas T3 y T4. - Fragmento de la región intergénica del fago f1 (f1 IG).
- El origen de replicación de S. pombe (ars1+),
necesario para que el plásmido se mantenga de forma autónoma.
- El gen LEU2 o URA3 de S. cerevisiae, capaz de complementar la mutación leu1-32 o ura4.Δ18 de
S. pombe.
3.1. Obtención de DNA y reacción
en cadena de la polimerasa (PCR)
Para la extracción de DNA plasmídico de
E. coli de manera rápida y a pequeña escala
(minipreps o minipreparaciones), se empleó el método de lisis alcalina Sambrook y Russell (2001). En los casos en los que era necesaria una concentración mayor de DNA y de mayor pureza, se recurrió a las columnas de intercambio iónico incluidas en el Quantum Prep® Plasmid Miniprep
Kit (BioRad), siguiendo las indicaciones del
fabricante. La extracción de DNA plasmídico y/o genómico de la levadura de fisión, se realizó según los protocolos descritos por Moreno et al. (1991). La amplificación de fragmentos de DNA mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) se realizó en un termociclador MinicyclerTM (MJ
Research) y diferentes polimerasas: Expand High Fidelity (Roche), VentR® DNA Polymerase (New England Biolabs®) o Biotools DNA polimerasa (Biotools). La reacción se efectuó siguiendo las
instrucciones de la casa comercial en cada caso. Por lo general, se desnaturalizaba el DNA molde por incubación a 94ºC durante 5 minutos, seguido de 30 ciclos consistentes en los siguientes pasos: 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a temperaturas que oscilaban entre los 50 y 58ºC, para permitir el anillamiento de los oligonucleótidos y 1 minuto de extensión a 72ºC por cada kilobase de DNA a amplificar, para permitir la síntesis de las cadenas de DNA. Al finalizar el último ciclo, se realizaba una extensión adicional a 72ºC durante 10 minutos. Los oligonucleotidos empleados en este trabajo están recogidos en la Tabla 4 (Anexo I).
3.2. Manipulación del DNA
Los procedimientos empleados para la manipulación del DNA son los recogidos en el manual de laboratorio de Sambrook y colaboradores (2001), salvo en aquellas ocasiones en las que se utilizaron kits comerciales, en las que se siguieron las instrucciones de la casa fabricante. El análisis de los fragmentos de DNA obtenidos por PCR o por tratamiento con enzimas de restricción se realizó mediante electroforesis en geles de agarosa (SeaKem®
ME Agarose, FMC Bio Products) preparados a
concentración variable entre 0,8% y 1,5%, según el tamaño de los fragmentos a separar. Los geles se prepararon con tampón TAE (Tris-acetato 40 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5-7,8) y añadiendo bromuro de etidio (0,5 mg/ml). El aislamiento y purificación de fragmentos específicos se realizó cortando la banda de DNA de interés tras su electroforesis en un gel de agarosa de bajo punto de fusión (NuSieve® GTG® Low melting
temperature agarose, FMC Bio Products), que
se funde por calentamiento a 65ºC durante unos minutos, y posterior procesamiento con el Gel
Band Purification Kit (GE Healthcare). La ligación
de fragmentos de DNA se realizó utilizando la ligasa del fago T4 (Roche), incubando la mezcla de la reacción durante, al menos, dos horas a temperatura ambiente. La mezcla de la ligación se empleó para transformar directamente E. coli.
3.3 Plásmidos utilizados en el
estudio de eng2
pJED12: eng2
Este plásmido portaba la secuencia codificante de eng2+ (con su propio promotor y terminador)
obtenida a partir del plásmido pSPE351 cortando con SalI y SacI. Este fragmento se clonó entre los sitios SalI y SacI del vector pAU-KS.
pJED13: eng2-E537A
Se amplificaron fragmentos de unos 200-900 pb utilizando parejas de oligonucleótidos específicos (743-1440 y 744-1445) utilizando como molde el plásmido pJED12. A continuación, los fragmentos resultantes fueron fusionados y clonados entre los sitios BamHI y SpeI del plásmido pJED12. pJED14: eng2-mCherry (marcador URA3) Se amplificaron fragmentos de unos 800-750- 400 pb utilizando parejas de oligonucleótidos específicos (1440-1441, 1442-1443 y 1444- 1445) utilizando como molde DNA genómico. A continuación, los fragmentos resultantes fueron fusionados y clonados entre los sitios BamHI y
SpeI del plásmido pJED12.
pJED15: eng2Δ14-28
Se amplificaron fragmentos de unos 1200-300 pb utilizando parejas de oligonucleótidos específicos (366-1447 y 1446-1454) utilizando como molde el plásmido pJED12. A continuación, los fragmentos resultantes fueron fusionados y clonados entre los sitios SalI y NcoI del plásmido pSPE351. El plásmido resultante fue cortado con SalI y SacI, el fragmento que contenía eng2Δ14-28 fue clonado en vector pAU-KS entre los sitios SalI y SacI. pJED16: eng2Δ1-303
Se amplificaron fragmentos de unos 1200-450 pb utilizando parejas de oligonucleótidos específicos (366-1452 y 1453-1454) utilizando como molde el plásmido pJED12. A continuación, los fragmentos
resultantes fueron fusionados y clonados entre los sitios SalI y NcoI del plásmido pSPE351. El plásmido resultante fue cortado con SalI y SacI, el fragmento que contenía eng2Δ1-303 fue clonado en el vector pAU-KS entre los sitios SalI y SacI. pJED17: eng2Δ348-706
Se amplificaron fragmentos de unos 900-400 pb utilizando parejas de oligonucleótidos específicos (366-1450 y 1451-1445) utilizando como molde el plásmido pJED12. A continuación, los fragmentos resultantes fueron fusionados y clonados entre los sitios SalI y SpeI del plásmido pJED12. pJED18: eng2-mCherry (marcador LEU2) El plásmido pJED14 fue cortado con SalI y SacI, el fragmento que contenía eng2-mCherry fue clonado en vector pAL-KS entre los sitios SalI y
SacI.
pJED19: eng2Δ14-28-mCherry
El plásmido pJED14 fue cortado con BamHI y SpeI, el fragmento que contenía el extremo C-terminal de eng2-mCherry fue clonado en plásmido pJED15 entre los sitios BamHI y SpeI. pJED20: eng2Δ1-36
Se amplificaron fragmentos de unos 1200-1200 pb utilizando parejas de oligonucleótidos específicos (366-1472 y 1471-1454) utilizando como molde el plásmido pJED12. A continuación, los fragmentos resultantes fueron fusionados y clonados entre los sitios SalI y NcoI del plásmido pSPE351. El plásmido resultante fue cortado con SalI y SacI, el fragmento que contenía eng2Δ1-36 fue clonado en vector pAU-KS entre los sitios SalI y SacI. pJED21: eng2Δ1-36-mCherry
El plásmido pJED14 fue cortado con BamHI y SpeI, el fragmento que contenía el extremo C-terminal de eng2-mCherry fue clonado en plásmido pJED20 entre los sitios BamHI y SpeI.
3.4. Transformación de bacterias y
levaduras
3.4.1. Transformación de E. coli
La transformación de la cepa bacteriana DH5α con las mezclas de ligación se realizó según el procedimiento diseñado por Kushner (1978) basado en el choque térmico. Para amplificar plásmidos ya construidos, se recurrió a
un método simplificado descrito por Golub (1988).