Proceso de elaboración de sueros antitoxina

Diseño del antiveneno: selección del veneno de serpiente

La selección de los venenos más adecuados para la producción de antiveneno necesita ser cuidadosamente analizada y debe tener en cuenta:

- la región geográfica donde será usado el antiveneno. - las especies médicamente más relevantes de esa región.

- la variabilidad de composición del veneno de una misma especie en esa región - la información sobre la neutralización cruzada de antivenenos ante venenos de

especies no incluidas en la mezcla de venenos usados para inmunizar a los animales para la fabricación de antiveneno.

Un tema importante en el diseño del antiveneno es definir si tienen que tener actividad monoespecífica o poliespecífica.

Los antivenenos monoespecíficos tienen el uso limitado para una única especie de serpiente venenosa o para un grupo pequeño de especies relacionadas que presenten neutralización cruzada. Estas condiciones se aplican en áreas donde:

- solo hay una especie médicamente importante (e.g Vipera berus en el Reino Unido i Escandinavia)

- un simple análisis de sangre, adecuado incluso para centros de salud periféricos, con el que se define a la especie mordedora (e.g detección de sangre coagulada en el tercio norte de África donde solo Echis spp causa coagulación de la sangre) - una simple aproximación algorítmica permite deducir las especies de un patrón

de características clínicas y biológicas.

- existe un test inmunodiagnóstico rápido, fiable y asequible para identificar las toxinas sin ambigüedades.

Por su parte, los antivenenos poliespecíficos están recomendados en países habitados por varias especies de relevancia médica y donde no hay síndromes clínicos distintivos que dirijan el uso de un antiveneno monoespecífico. Pueden crearse mediante la inmunización de animales con una mezcla de venenos de diferentes especies. El antiveneno obtenido contendrá anticuerpos contra los componentes de los diferentes venenos. Existen otras dos formas de obtenerlo:

- inmunizando animales diferentes con el veneno de una sola especie y después mezclar diferentes plasmas hiperinmunizados para el fraccionamiento; o

- mezclando cantidades adecuadas de antivenenos purificados pertinentes antes de la formulación. En este caso es importante monitorizar la potencia de cada antiveneno monoespecífico para garantizar que la potencia de la mezcla en el producto final es consistente.

En algunas regiones, se puede distinguir diferentes presentaciones clínicas (neurotóxica, daño tisular local y/o perturbaciones hematológicas), por lo que se justifica la preparación de antivenenos poliespecíficos separados ante cada una de ellas.

* Puntos clave:

- Cuando se seleccionen los antivenenos las autoridades sanitarias nacionales primero deben obtener y considerar la información de las especies locales y su relativa importancia médica.

- El diseño de la mezcla de veneno usada en la inmunización, y la decisión de preparar antivenenos monoespecíficos o poliespecíficos, dependen de la información epidemiológica y clínica referente a las mordeduras de serpiente en ese territorio en particular.

- Debido a la dificultad para identificar clínicamente las especies de serpiente responsables del envenenamiento, el uso de antivenenos poliespecíficos adecuados a la zona geográfica es más conveniente que no el uso de un antiveneno monoespecífico.

- La preparación de antivenenos mediante la inmunización de animales con una mezcla de venenos de serpientes relacionadas taxonómicamente puede resultar en un mayor título de antiveneno.

- Un fabricante que solicite una autorización para comercializar antiveneno en una región específica, debe mostrar evidencias experimentales de pruebas preclínicas de que el producto presenta capacidad de neutralización ante los diferentes venenos locales.

Preparación y almacenamiento del veneno de serpiente

El veneno se usa tanto para hiperinmunizar los animales, dentro de la producción de antiveneno, como para proporcionar muestras referencia para la evaluación rutinaria o preclínica de la potencia de los antivenenos. Los venenos usados deben ser representativos de la población des serpientes de la zona donde el antiveneno será distribuido. Para ello, es indispensable que se recolecten juntos el veneno de no menos de 20-50 especímenes.

Los productores de veneno deben seguir rigurosamente las siguientes recomendaciones y proporcionar pruebas del cumplimiento de:

- origen geográfico y tamaño (y por lo tanto, la edad aproximada) de cada una de las serpientes usadas en el proceso.

- detalles taxonómicos de cada serpiente usada.

- aplicación correcta de los documentos CITES (Convention on International Trade in Endangered Species) en el caso de especies en peligro de extinción. - medidas preventivas en para evitar recolectar veneno de serpientes enfermas. - identificación individual de serpientes que contribuyen en cada lote.

- trazabilidad de cada lote de veneno.

También es muy recomendable que cumplan lo siguiente: - congelar rápidamente del veneno después de la recolecta. - liofilizar el veneno en almacenamientos a largo plazo.

- confirmación de la similitud entre lotes de veneno del mismo origen.

Producción de veneno de serpiente para la inmunización

Todas las nuevas serpientes adquiridas deben estar en cuarentena un mínimo de 2 meses en una sala especial (“sala de cuarentena”) que debe estar localizada lo más lejos posible de la “sala de producción” donde se mantiene las serpientes cualificadas para ser ordeñadas. Las serpientes enfermas deben ser tratadas y su cuarentena tiene que extenderse hasta 2 meses una vez totalmente recuperadas clínicamente. Los animales enfermos encontrados en la “sala de producción” pueden ser tratadas in situ pero no pueden ser ordeñadas. Si se usa un tratamiento antibiótico, la serpiente no puede ser ordeñada durante las 4 semanas siguientes al final del tratamiento. Cuando están bien mantenidas, las serpientes adultas pueden vivir en una granja de serpientes durante 10 o más años.

Es preferible ubicar a las serpientes en terrarios separados suficientemente grandes para permitirles moverse. Decenas de terrarios pueden ser acomodados en la misma “sala de producción”, proporcionando un espacio suficiente para el mantenimiento y el ordeño. En el acceso a la sala debe haber una bandeja que contenga un antiséptico, de forma que el calzado toda la gente que entre sea automáticamente tratado. El acceso debe ser restringido al personal responsable de su mantenimiento. La sala tiene que estar cerrada, con cualquier ventana cerrada permanentemente o protegida por barrotes y mosquiteras. Se debe evitar tener simultáneamente abiertas dos puertas y el espacio debajo de éstas no debe ser superior a 3mm. Serpientes de la misma especie, recogidas al mismo tiempo deben ser ubicadas en el mismo rack.

Cuando hay diferencia entre la composición del veneno de un ejemplar joven o adulto de la misma especie, como en el caso de las especies Bothrops i Crotalus, el veneno de cierta proporción de individuos jóvenes puede ser mezclado con el de adultos. Las serpientes son alimentadas normalmente después de ser ordeñadas, idealmente con ratones muertos u otras presas adecuadas a las diferentes especies de serpientes.

En la granja de serpientes, además de las salas dedicadas a la producción y mantenimiento de serpientes, también debe haber espacio para salas de limpieza de los terrarios, cría de ratones y ratas, almacenamiento y conservación del veneno producido o laboratorios de control. Es deseable que en sala de limpieza se disponga de dos conjuntos de limpieza, uno de grande para el equipamiento de producción de veneno y otro más pequeño para el equipamiento del área de cuarentena. La cría de ratones y ratas no se puede llevar a cabo en la misma sala debido al estrés que las ratas producen en los ratones. Si se cría una serpiente en la granja, son necesarios una incubadora de huevos y salas especiales para recién nacidos. Cuando sea posible, disponer de un pequeño laboratorio para realizar controles de calidad puede llegar a ser es muy útil.

A continuación se describirá el proceso de obtención del veneno, es decir, el ordeño. Todas las operaciones deben ser descritas en procedimientos escritos, que tienen que ser comprobados y revisados periódicamente de acuerdo con un documento maestro. Los pools de veneno requieren números de lote únicos, y los venenos que contribuyen a formar el pool deben ser trazables. El intervalo entre ordeños es variante y oscila entre

cada 2 o 3 semanas hasta cada 2 meses, excepto para especímenes que están en cuarentena o bajo tratamiento y serpientes en proceso de cambio de muda.

La serpiente se retira del terrario suavemente con un gancho y se coloca sobre una almohadilla de goma espuma antes de ser sujetada por detrás de la cabeza. Para especies muy peligrosas, el uso de anestesia general de corta acción, o frío moderado (15ºC) durante el ordeño, puede considerarse para disminuir el riesgo de accidente tanto para la serpiente como para el manipulador. Para recolectar el veneno, se agarra la cabeza de la índice, justo detrás del ángulo de la mandíbula, mientras el cuerpo

de la serpiente se sostiene entre el tronco y el brazo del manipulador (fig. 10). Un asistente puede ocluir suavemente la cloaca de la serpiente para prevenir la contaminación de la zona por heces. Aplicando una suave presión, se fuerza la apertura de las mandíbulas, la exposición de los colmillos, y en el caso de las víboras, la erección de éstos. Los colmillos se empujan a través de una membrana de plástico/parafilm enganchado sobre el borde de un recipiente de vidrio, y el veneno se expulsa. El uso de contenedores de silicona minimiza la adhesión de veneno en las paredes del recipiente. Cualquier muestra de veneno contaminada con sangre debe ser desechada. Después de la extracción del veneno, los colmillos son cuidadosamente retirados del recipiente de recolección, previniendo posibles daños en la boca y dentadura, así como evitando que la serpiente se muerda a sí misma. Después de cada ordeño, los materiales utilizados deben ser esterilizados y seguidamente enfriados con una corriente de aire. A la vez que se ordeña, se puede comprobar el estado bucal y de los dientes de la serpiente, así como examinar la presencia de ectoparásitos o pentastómidos. El ordeño también se aprovecha para realizar mientras tanto la limpieza y desinfección del terrario. serpiente entre el dedo pulgar e

Fig. 10. David Bitis ordeñando una víbora del Gabón

Diferentes serpientes del mismo grupo (misma especie o subespecie recogidas en la misma área al mismo tiempo) pueden ser ordeñadas en el mismo recipiente. Es importante para la mayoría de venenos ser congelados rápidamente a -20ºC o menos grados en la hora siguiente a la extracción.

Es importante identificar el vial en el que el veneno se ha recolectado con un número de referencia adecuado, que permite saber las serpientes usadas, el día del ordeño, el nombre del operador y otra información importante. Durante el ordeño, se recomienda vestir ropa protectora y una máscara así como guantes de vinilo para prevenir accidentes e infecciones. El equipo usado para el almacenaje del veneno congelado y liofilización, debe ser lavado para evitar contaminaciones cruzadas.

También es posible recolectar veneno de serpientes salvajes. En este caso, el equipo de recolección debe incluir un herpetólogo o zoólogo para identificar las serpientes. Las serpientes que se encuentren enfermas, heridas o hembras grávidas no deben ser ordeñadas. El manejo y ordeño de la serpiente se debe realizar en un ambiente donde haya el menor riesgo de contaminación externa, como por ejemplo el interior de un vehículo. El veneno obtenido debe ser congelado lo antes posible.

Personal responsable del manejo de las serpientes

Ordeñar es una operación peligrosa, pues se han documentado casos de mordeduras y el consiguiente envenenamiento. El personal debe estar bien entrenado y debe entender el riesgo de ser mordido y envenenado. Para evitar esto, se debe usar ropa protectora, cubrirse los ojos con gafas (sobre todo con serpientes escupidoras). Si el veneno esta liofilizado o desecado, ya que los aerosoles que se forman pueden afectar a las personas a través de heridas o membranas mucosas y del ojo.

En caso de mordedura se debe pedir ayuda, devolver la serpiente a su terrario o caja y transportar la víctima a un área designada para primeros auxilios. Una inmovilización inmediata aplicando presión es adecuada para tratar mordeduras que contengan venenos neurotóxicos. En caso de entrar en contacto con los ojos, es urgente una irrigación con un volumen generoso de agua limpia. Como precaución, toda víctima debe ser trasladada a un hospital. Llevar la etiqueta identificadora de la serpiente causante de la mordedura resulta de gran ayuda para garantizar una buena elección con el antiveneno .

* Puntos clave:

- Las granjas de serpientes bien gestionadas son la clave para la producción de preparados de veneno que cumplan los requisitos para una efectiva producción de antivenenos.

- Los procedimientos de mantenimiento, manejo y ordeño de las serpientes, así como todos los aspectos de la recolección de veneno deben estar adecuadamente documentados y programado

- Los venenos usados en la preparación de antiveneno deben ser representativos de la población de serpientes de una zona concreta (mínimo 20-50 muestras)

Un fabricante de veneno debe ser capaz de demostrar lo siguiente:

- La identidad taxonómica y origen geográfico de cada uno de los animales usados para la producción de veneno deben ser conocidos y registrados.

- La ubicación, alimentación y manejo de serpientes debe seguir protocolos documentados.

- El personal tiene que estar bien entrenado y debe trabajar bajo medidas de salud y seguridad.

- No se debe ordeñar animales enfermos, y estos deben establecerse en cuarentena. - La trazabilidad de cada lote de veneno debe estar garantizada.

- Los venenos deben ser congelados como antes posible, como mínimo durante la primera hora.

Control de calidad de los venenos

Es vital identificar con precisión las especies de cada serpiente usada para la producción de veneno y la taxonomía debe ser validada por un herpetólogo competente. Para ello, tradicionalmente se usan características como por ejemplo el patrón de colores, aunque actualmente también se usa el análisis de ADN. Toda la información referente a cada lote individual de veneno debe estar disponible ante la solicitud de un auditor o ante un control de las autoridades. En el caso de almacenamiento a largo plazo, los venenos pueden ser resecados regularmente para garantizar el contenido mínimo de agua, para mantener su estabilidad.

Debido a la gran variedad en la composición de los venenos incluso de una misma especie se recomienda que se establezcan unas referencias nacionales que cubran en su totalidad la variabilidad interespecie. Establecer venenos de referencia garantiza que los antivenenos producidos serán probados contra los venenos más relevantes de países y regiones específicas. Es responsabilidad del productor de veneno proporcionar toda la información referente a las serpientes usadas en el proceso, los controles de calidad y los estudios preclínicos. Ésta información debe ir incluida en el dossier técnico junto a la autorización de comercialización de cualquier antiveneno.

Además de toda la información anteriormente comentada, también se tiene que añadir información bioquímica y biológica. Ésta puede incluir el análisis de:

- Características bioquímicas del veneno: o concentración de proteínas.

o perfiles de la cromatografía de exclusión de tamaño - Actividad enzimática y toxicológica del veneno:

o dosis letal media (DL50)

* Puntos clave:

- El control de calidad del veneno es esencial para garantizar que es representativo de la zona donde se quiere distribuir el antiveneno

- La trazabilidad de cada veneno es importante para la detección rápida de cualquier error que pueda ocurrir durante el proceso de preparación.

- Información bioquímica y biológica adicional se debe presentar además de la ya comentada anteriormente.

Selección y atención veterinaria de los animales usados para la producción de antivenenos

Antes de que un animal sea introducido en la manada usada en un programa de producción, debe ser sometido a un periodo de cuarentena (según el país, de 6 a 12 semanas). Después del periodo de cuarentena, si el animal está sano según un examen veterinario, y los resultados de varias pruebas serológicas dan negativo, el animal se puede incorporar a la manada. En el caso de caballos y otros équidos, los animales de entre 3 y 10 años son normalmente incluidos en el programa de producción. En el caso de las ovejas, los animales que se retiran de la producción de lana han demostrado

capacidad para producir anticuerpos útiles durante varios años. No hay ninguna raza preferida, pero en general los caballos y ovejas grandes son preferibles porque con ellos se obtienen grandes volúmenes de sangre.

Dependiendo de la localización epidemiológica, los animales deben ser vacunados contra el tétanos y posiblemente otras enfermedades endémicas como la rabia, influenza equina, ántrax o brucelosis. El personal que entre en contacto con estos animales debe ser vacunado contra la rabia y el tétanos. Hay que tener un registro individual para cada animal usado en el programa de inmunización. La respuesta inmunitaria ante los componentes de los venenos debe ser seguida para detectar cuando el animal alcanza un título adecuado de antiveneno.

Si un animal muestra algún signo de enfermedad, debe ser retirado del programa para ser tratado. Si se controla la enfermedad, puede retornar a la manada después de un tiempo apropiado, normalmente 4 semanas. En caso de vacunación, el periodo de espera para retornar al programa no debe ser menor a 1 mes. Como consecuencia a la inmunización con veneno, un problema común es el desarrollo de úlceras o abscesos locales (estériles o infectados). Este es un problema frecuente cuando se usan venenos necrotizantes. La solución pasa por realizar todas las inyecciones bajo condiciones asépticas.

* Puntos clave:

- Todos los animales deben pasar por un periodo de cuarentena de entre 6 y 12 semanas

- Durante el programa, si un animal enferma, debe ser separado temporalmente para recibir tratamiento. Hay que prestar atención a las zonas de inyección.

- La respuesta inmunológica al veneno debe ser monitorizada, así como los títulos de antiveneno mediante análisis del plasma.

- Un animal que reciba un antibiótico u otro medicamento debe ser retirado del programa por un periodo no inferior a 1 mes.

Pautas de inmunización y el uso de adyuvantes

Para conseguir el objetivo deseado, son importantes las siguientes consideraciones: - los venenos usados deben ser preparados como se ha descrito anteriormente y

deben estar en óptimas condiciones para inducir anticuerpos específicos y neutralizantes.

- las pautas de inmunización no deben afectar seriamente la salud del animal. - la inmunización debe ser técnicamente simple y económica para usar la menor

cantidad de veneno posible.

Como ya hemos comentado, los animales grandes son preferibles a los pequeños debido a que producen un mayor volumen de antiveneno. Entre los animales grandes, el caballo es el de elección para la producción de antiveneno comercial, puesto que es dócil, prospera en la mayoría de climas y tiene una grande cantidad de plasma. La oveja también se ha usado como alternativa porque es más barata, fácil de criar, puede tolerar mejor los adyuvantes oleosos y sus anticuerpos pueden ser de utilidad en pacientes que son hipersensibles a las proteínas equinas. Cuando se usa una oveja o cabra, los productores deben cumplir con las regulaciones para minimizar el riesgo de transmisión de las encefalopatías espongiformes a los humanos.

Preparación de las dosis de veneno

Para preparar las dosis de veneno, toda la manipulación del veneno debe ser realizada usando técnicas asépticas, y en el caso de venenos altamente tóxicos se puede usar una vitrina citotóxica. Los lotes de veneno usados para inmunizar a los animales deben ser registrados y los contenedores donde el veneno se disuelve deben ser debidamente identificados. Los venenos, cuando se liofilizan, son muy higroscópicos y alergénicos,