Proceso de Germinación de los embriones de Brugmansia candida

Siguiendo los protocolos descritos en la parte de materiales y métodos (numerales 3.1.1 y 3.2.1) para la producción de raíces no transformadas de Brugmansia candida, los primeros ensayos condujeron a los siguientes resultados respecto a los tiempos de germinación, ver tabla 2.

Del total de embriones sembrados, al día 30, 115 embriones no habían germinado ni se habían contaminado. Al día 45, eran 29 los embriones que no habían incurrido en los procesos descritos anteriormente.

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Tabla 2. Resultados correspondientes al proceso de germinación de embriones de Brugmansia candida en medio B5 libre de hormonas.

Embriones sembrados Embriones no contaminados, Germinados Embriones contaminados %Germinación no Contaminadas % Contaminación

Día 30 Día 45 Día 30 Día 45 Día 30 Día 45 Día 30 Día 45

246 87 165 44 52 43 85 18 21

Para complementar este experimento, se observó el crecimiento de estas raíces después de inocularlas en medio líquido B5. En esta etapa experimental se evaluaron dos condiciones distintas, la primera con radículas de 1,5 a 2 cm obtenidas luego de 30 días de germinación. La segunda alternativa estudiada consistió en realizar ensayos con los inóculos que alcanzaron dicha condición luego de 45 días de cultivo de los embriones sobre el medio sólido.

Figura 32. Aislamiento de embriones de Brugmansia candida con el tamaño

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Las fracciones radiculares se sembraron en medios líquidos B5, suplementados con sacarosa a 20 g/l. Luego de 21 días de cultivo se estudió el cambió en el peso fresco y la concentración de los alcaloides, los resultados se consignan en la tabla 3:

Tabla 3. Crecimiento de raíces de Brugmansia candida y producción de alcaloides

en medio líquido, usando inóculos que provienen de cultivos sobre medio B5 sólido de dos edades diferentes (30 y 45 días).

Edad de las raíces usadas como inóculo (días) Masa inicial de Inóculo (gramos) Masa final luego de 21 días de cultivo (gramos) % de Incremento de masa Producción especifica de escopolamina mg / g de raíz (peso seco) 30 0,24 ± 0,06 0,70 ± 0,21 194,54 11,2 ± 1,7 45 0,18 ± 0,04 0,33 ± 0,16 80,56 6,6 ± 0,6

Los datos presentados en la tabla 3, corresponden a los promedios obtenidos con 3 réplicas.

De estos resultados, se puede decir que los embriones que germinaron dando lugar a raíces de una longitud aproximada de 2 cm, en un periodo de 30 días, produjeron después de ser usados como inóculos en cultivos en medio líquido, masas finales equivalentes a 2,95 veces su masa inicial. Mientras que las raíces procedentes de embriones que se dejaron desarrollar durante 45 días, antes de ser usados como inóculos en medio líquido, alcanzaban masas finales iguales a 1,38 veces la masa inicial. En ambos casos las condiciones de los cultivos en medio líquido fueron temperatura ambiente y agitación de 70 rpm. Lo que puede traducirse, en que las raíces que tardaron más tiempo en alcanzar la condición requerida para convertirse en inóculos, continúan con una tendencia a crecer de manera más lenta luego de ser transplantadas al medio líquido. Igualmente se observó una disminución en la producción de alcaloides en ellas, pues las raíces

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que tardaron 30 días en la fase inicial del proceso produjeron 11,2 mg de escopolamina/gramo de raíz (masa seca), mientras que las raíces de 45 días produjeron 6,6 mg de escopolamina/ g de raíz (masa seca).

Todos estos elementos llevaron a concluir que los inóculos empleados en el sistema de biorreacción deberían corresponder a raíces generadas luego de 30 días desde la siembra del embrión sobre el medio sólido.

4.1.2 Efecto de la adición de ácido naftalenacético sobre el desarrollo de los embriones para la producción de raíces de Brugmansia candida

Este experimento fue realizado con el fin de evaluar si la adición de ANA, a los medios de cultivo, favorecía la obtención de raíces normales de B. candida a partir del cultivo de embriones. Se encontró que esta hormona sí afectó el desarrollo de las raíces, de modo que la morfología de las mismas variaba de manera apreciable entre un ensayo y otro.

En ausencia de ANA las raíces eran alargadas y delgadas, mientras que en los casos en donde se aplicaba ANA, las raíces presentaban deformaciones que se intensificaban a medida que se incrementaba la concentración de esta sustancia, haciéndose cada vez más cortas y gruesas, llegando en algunos casos a dar lugar a la formación de agrupaciones de células no diferenciadas (callos) sobre ellas.

En la figura 33, se ve que las raíces que crecen en medio suplementado con ANA, durante 60 días (ensayos 5, 6 y 7), tienen tendencia a producir agrupaciones celulares. Lo anterior indica que en estos casos la adición de la hormona se puede presentar como alternativa para el establecimiento de cultivos celulares y se debe descartar como alternativa para la rizogénesis directa a partir de los embriones.

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Figura 33. Imágenes de raíces normales de Brugmansia candida obtenidas en los

ensayos correspondientes a la aplicación de ácido naftalenacético en adición al medio B5 usado en el cultivo (ensayo 1: 0 ppm durante 60 días, ensayo 2: 1 ppm

durante 30 días, ensayo 3: 2 ppm durante 30 días, ensayo 4: 3 ppm durante 30 días, ensayo 5: 1 ppm durante 60 días, ensayo 6: 2 ppm durante 60 días, ensayo

7: 3 ppm durante 60 días).

En la tabla 4, se consignan los resultados correspondientes al peso seco de las raíces obtenidas en cada uno de los ensayos. A partir de dicha información se infiere que las raíces que crecieron en medio con ANA durante los 30 primeros días, y que luego fueron transferidas a medio libre de esta hormona, fueron las que alcanzaron mayores pesos. Esto indica que esta condición permite obtener la mayor cantidad de biomasa dentro de todas las opciones. De los tres

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experimentos que cumplieron con este requisito, el ensayo 4 (medio suplementado con 3 ppm de ANA), fue el que presentó la mayor producción de biomasa.

Tabla 4. Masa seca de raíces normales de Brugmansia candida obtenida a partir

del cultivo de los embriones, para cada una de las condiciones estudiadas de aplicación de ácido naftalenacético luego de 60 días.

Ensayo Masa de raíces secas por frasco (g)x 1 0,05 ± 0,01 2 0,07 ± 0,03 3 0,08 ± 0,01 4 0,14 ± 0,04 5 0,07 ± 0,02 6 0,04 ± 0,01 7 0,06 ± 0,02 x

Los valores incluyen la desviación estándar obtenida con las 5 replicas.

Se evaluó además el efecto del ANA sobre la producción de escopolamina (tanto la liberada al medio de cultivo como la retenida en los tejidos vegetales). La máxima cantidad de escopolamina extraída, 7,24 mg/ g de raíces secas, se obtuvo para el ensayo 1 (medio libre de ANA durante los 60 días). Como se muestra en la tabla 5, es claro que si el objetivo del cultivo es la producción del alcaloide, el emplear un medio libre de esta hormona es una buena alternativa.

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Tabla 5. Escopolamina extraída de raíces normales de Brugmansia candida en

cada uno de los ensayos realizados, aplicando concentraciones de ácido naftaleancetico variando entre 0 y 3 ppm.

Ensayo Escopolamina extraída

(mg/g raíces secas)

Escopolamina promedio producida en cada uno de los ensayos

(mg/frasco) 1 7,24 ± 0,72 0,36 2 5,07 ± 0,31 0,35 3 3,51 ± 0,28 0,28 4 1,96 ± 0,24 0,27 5 4,71 ± 0,28 0,33 6 3,69 ± 0,32 0,15 7 2,99 ± 0,33 0,18

Por lo general, los tratamientos en donde el ANA estuvo presente mostraron menores niveles de producción de escopolamina. Sin embargo, al comparar las dos condiciones evaluadas aplicando la hormona, se nota que el alcaloide está presente en una menor concentración, en las raíces que estuvieron en contacto con una mayor concentración de ANA durante los 60 días de cultivo.

Figura 34. Escopolamina producida luego de 60 días de cultivo de raíces

normales de Brugmansia candida por unidad experimental (frasco), para cada una de las condiciones de aplicación de ANA evaluadas.

0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0 1 2 3 m g d e E sc op ol am in a / Fr asc o Concentración de ANA (ppm) Exposición a ANA 1 vez Exposición a ANA 2 veces

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De estos resultados, que indican que la hormona causa deformación en las raíces y pérdida en su capacidad para producir escopolamina, se infiere que es mejor alternativa generar los inóculos a partir de cultivos de embriones desarrollados en medio libre de ella.