PROCESO HIDROLÍTICO DEL ALMIDÓN DE CEBADA SIN MALTEAR 53

Para establecer la concentración óptima de α y β amilasas comerciales en la obtención de etanol a partir de cebada sin maltear empleando Saccharomyces cerevisiae,se tuvieron en cuenta los siguientes factores: concentración de azúcares reductores, pH, temperatura, formación de biomasa y producción de etanol.

En orden a lo citado anteriormente, se experimentó con una concentración de cebada de 250 g/L, estipulada como la dosis equivalente en una base de cálculo de un litro, a la concentración empleada a escala industrial determinada en base a la experiencia práctica y teórica de la destilería, asegurando de esta forma el consumo total de los azúcares por parte de la levadura. Esta concentración se confirma con lo reportado por Kolusheva y Marinova (2007), quienes obtuvieron la mejor condición de hidrólisis de almidón con una concentración de sustrato de 250 g/L, ya que evidenciaron una inhibición generada por los azúcares reductores obtenidos durante la hidrólisis del sustrato en concentraciones superiores al 250 g/L. Para probar esta hipótesis, investigaron la influencia de la concentración de la glucosa añadida al sustrato sobre el tipo de reacción enzimática, concluyendo que la adición de glucosa en el inicio del proceso de hidrólisis, reduce significativamente la velocidad de reacción del proceso, y el porcentaje de esta reducción es proporcional a la cantidad de glucosa añadida.

Como es conocido, la tasa máxima de reacción enzimática es proporcional a la concentración de enzimas (Kolusheva y Marinova, 2007), por lo tanto, se determinó

la concentración de alfa y beta amilasas comerciales necesaria para degradar el almidón presente en la cebada no malteada, de tal forma que Saccharomyces cerevisiae utilice los productos de la hidrólisis como fuente de energía. Se examinó esta influencia en un rango de concentraciones entre 5-25 mL enzimas por litro de suspensión. En la Gráfica 1 se observa la relación obtenida entre la concentración de azúcares reductores y las dosis de enzimas adicionadas para el proceso hidrolítico, evidenciando cómo la concentración de azúcares reductores aumenta a medida que se incrementa la dosis de enzima, hasta la concentración de de 20 mL/L, como respuesta a la hidrólisis de almidón, demostrándose que el medio y las condiciones utilizadas para el proceso hidrolítico, llevado a cabo por la acción catalítica de las enzimas Multifect® AA 21L y Multifect® AA 23L fueron los adecuados. Sin embargo, Kolusheva y Marinova (2007) reportan, que la mayoría de las veces la hidrólisis enzimática se lleva a cabo con α-amilasas y con menos frecuencia son empleadas las β-amilasas, demostrándose con los resultados obtenidos que estas dos enzimas pueden llegar realizar una labor sinérgica para hidrolizar el almidón de la cebada sin maltear. Además, de acuerdo con lo reportado Eglinton (1998), las beta-amilasas son enzimas claves en la degradación del almidón de la cebada germinada (Hordeum vulgare L.), la cual es sintetizada durante el desarrollo de la cebada grano, en contraste con otras importantes enzimas hidrolíticas que son sintetizados durante la germinación.

Gráfica 1. Concentración de azúcares reductores en función de la dosis de de enzimas, (C+) control de comparación y (C-) control negativo después de la hidrólisis por 8h.

En la Gráfica 1 se observa, que el valor obtenido de azúcares reductores en el control negativo, fue inferior en relación a los valores obtenidos en todos los ensayos con enzimas, demostrando que efectivamente se logró hidrolizar el almidón de la cebada sin maltear reflejándose en el aumento de la concentración de azúcares reductores, desaparición del característico color azul con yodo (Ver Figura Anexo 5.2), y en la turbidez y color del medio (Ver Figura Anexo 5.1) (Norris y Richmond, 1981).Por lo que se podría considerar el uso estas como una ayuda para mejorar el rendimiento hidrolítico del almidón de la cebada sin maltear, utilizada en el proceso de producción de la destilería.

Teniendo en cuenta, que generalmente la acción de α y β amilasas sobre el almidón natural de los granos no es muy efectiva por que estos presentan una resistencia a la digestión amilolítica (Sarikaya et al., 2000), los valores obtenidos de las concentraciones de azúcares reductores, demuestran lo reportado por Lauro (2001), donde la acción hidrolítica de las amilasas sobre el almidón de granos de cebada se lleva a cabo porque estas enzimas erosionan la superficie del grano o digieren canales en puntos seleccionados en la superficie hacia el centro del grano, permitiendo la difusión de la enzima hacia el sustrato, la adsorción de la enzima sobre el sustrato y el evento catalizador.

En la Gráfica 1, se evidencia una caída en los valores de la concentración de azúcares reductores entre la concentración con 20 mL/L y 25 mL/L, la causa de este hecho según lo reportado por Kolusheva y Marinova (2007), se debe a que entre mayor sea la concentración de enzimas y menor sea el sustrato disponible, la tasa de reacción disminuye, porque hay menos lugares de reacción activos disponibles para hidrolizar el almidón, generando una limitante por exceso de enzimas. Comparando los resultados anteriores, se determinó que la concentración óptima de enzimas para producción del mosto ó hidrolizado de fermentación es 20 mL/L, ya que la utilización de concentraciones mayores no se traduce en un aumento de la tasa de reacción enzimática (Tabla Anexo 4.1).

Kolusheva y Marinova (2007), reportan en su trabajo que los parámetros básicos que afectan al proceso de hidrólisis son la temperatura, el tiempo de hidrólisis, el pH

del medio, la concentración del sustrato y la concentración de la enzima, los cuales varían dependiendo de la enzima. Teniendo en cuenta lo anterior, todos los ensayos se desarrollaron bajo las mismas condiciones de pH (5.5), temperatura (95oC para

α- amilasa y 57oC para β-amilasa), y tiempo de hidrólisis (8 horas). Los resultados obtenidos del proceso hidrolítico, concuerdan con los obtenidos en el estudio de la influencia de la temperatura sobre la tasa de hidrólisis por Kolusheva y Marinova (2007), quienes determinaron que la tasa de la reacción enzimática es casi idéntica a 90°C y 100°C, eligiendo 90°C como la temperatura óptima. De igual forma, Hill et al. (1997) reportaron que la mayor tasa de hidrólisis obtenida con una α-amilasa fue pH 5.5. En cuanto al tiempo de hidrólisis, Kolusheva y Marinova (2007) en sus resultados sobre la influencia del tiempo de hidrólisis en la concentración de azúcares reductores, obtuvieron la máxima concentración de azúcares reductores y, por ende, el nivel máximo de hidrólisis después de 4 horas y 15 minutos. Sin embargo, reportan que el comportamiento hidrolítico de otra amilasa termoestable, sintetizada por B. licheniformis MB-80 tuvo una duración superior a 7 horas, lo que concuerda con el tiempo empleado para la hidrólisis del almidón de cebada, y confirmándose con los valores de las concentraciones de azúcares reductores de la Grafica 1.

Tabla 6. Datos del rendimiento de hidrolisis obtenidos en el proceso hidrolítico. Dosis de Enzimas (mL/L) Rendimiento de hidrólisis (%) 5 66.9964 10 67.3686 15 73.1762 20 89.4376 25 65.3359 Control de comparación 41.8491 Control Negativo 3.8570

Otro parámetro evaluado fue el rendimiento de hidrólisis, estos datos están presentados en la Tabla 6, exhibiendo que la prueba con el mejor rendimiento de hidrolisis fue con la dosis con 20 mL/L (89,44%), seguida de la dosis con 15 mL de enzimas (73.17%), demostrándose que la presencia de enzimas es fundamental para la obtención de un mejor rendimiento hidrolítico, ya que en todos los tratamientos con enzimas y en el control de comparación se obtuvo un rendimiento satisfactorio en relación al control negativo, en el cual la concentración de amilasas es insuficiente para la degradación completa del almidón presente en la cebada, razón por la cual el valor del rendimiento de hidrólisis es bajo.

Al igual que en la liberación de azúcares reductores, la tendencia seguida por el rendimiento de la hidrólisis enzimática es similar, tal como se aprecia en la Gráfica 2, coincidiendo con lo reportado por Chen et al. (2007), quienes reportaron este parámetro para la determinación del efecto de la concentración de sustrato y de enzimas en el proceso de hidrólisis enzimática, donde la concentración de azúcares reductores tenía una tendencia de variación similar al rendimiento de hidrólisis, aumentando ambas a medida que la concentración de enzimas era mayor.

Gráfica 2. Relación azúcares reductores producidos y rendimiento de hidrólisis en función de la concentración de enzimas, (C+) control de comparación y (C-) control negativo.

Los análisis estadísticos fueron realizados por medio del programa computarizado SPSS vs 10, en donde se cumplió la hipótesis alterna (ver numeral 5.8), presentando diferencias significativas entre los tratamientos (Ver Tabla Anexo 9.1 y 9.2), confirmando que las dosis de enzimas influyen significativamente en la concentración de azúcares reductores (p<0,005) y del rendimiento de la hidrólisis enzimática (p<0,005), obteniendo la mayor concentración de estos en el tratamiento con 20 mL/L de enzimas.