Productos de degradación de la proteína codificada por el transgen en subproductos A diferencia de las sustancias químicas ingeridas, las proteínas provenientes de alimentos

tienen un destino metabólico predecible en el intestino animal o humano, independientemente del origen del alimento, sea derivado de un cultivo convencional o genéticamente modificado. Para evaluar la predicción metabólica de proteínas, sean nuevas o convencionales, se han utilizado ampliamente estudios in vitro con soluciones digestivas simuladas para investigar la digestibilidad de proteínas vegetales, proteínas animales y aditivos de alimentos para evaluar la calidad de proteínas para estudiar la digestión en cerdos y en aves de corral para medir la velocidad de disolución de tabletas con el fin de monitorear la biodegradación de aplicaciones farmacéuticas y para investigar la liberación controlada de fármacos experimentales.

Generalmente, la mayoría de los alérgenos en los alimentos tienden a ser estables a las condiciones ácidas y pépticas del sistema digestivo a fin de alcanzar y pasar a través de la mucosa intestinal para provocar una respuesta alérgica (Metcalfe et al., 1996; Taylor et al., 1987; Taylor, 1992). Sin embargo, algunos investigadores (Veiths et al., 1999; Kenna y Evans, 2000; Fu, 2002; revisado por Fu et al., 2002) han cuestionado la validez de la estabilidad digestiva como criterio para la evaluación de la alergenicidad en las proteínas. Sin embargo, en la actualidad, la información sobre la digestibilidad gástrica puede utilizarse en un enfoque integral basado en el peso de la evidencia para evaluar el potencial alergénico. Los alérgenos de proteínas conocidos tienden a presentar estabilidad térmica y de procesamiento, mientras que las proteínas lábiles en alimentos que se comen cocidos o que se someten a otro tipo de procesamiento antes del consumo son de menor preocupación.

1.17.1 Híbrido de maíz BT11 x MIR162 x MIR604 x GA21

Las secuencias de las proteínas novedosas expresadas en el híbrido de maíz con la tecnología BT11 x MIR162 x MIR604 x GA21, son las mismas que se expresan individualmente en los eventos parentales y por consiguiente tienen las mismas características reportadas para estos. Sin menoscabo de lo anterior, a continuación se expone lo referente a cada uno de los eventos parentales.

1.17.2 Evento parental BT11

La proteína Cry1Ab como cualquier proteína es susceptible de ser degradada en soluciones ácidas (estómagos de animales y humanos), así como por las proteasas presentes en el tracto digestivo de cada especie. Diversos estudios se han realizado con animales alimentados con maíz GM que expresa la proteína Cry1Ab, entre ellos con vacas lactantes, becerros y puercos, en los que se encontró que la proteína se degrada al pasar por el tracto digestivo, en péptidos de menor tamaño, no encontrándose en tejidos de órganos importantes y que las trazas de péptidos detectables en las heces de estos animales se degradan en medio ambiente muy rápidamente no representando riesgo alguno al medio ambiente (Chowdhury et al., 2003 a y b; Lutz et al., 2005). Por otro lado, los estudios no han reportado la presencia de la proteína en fluidos gástricos o heces (Guertler et al., 2008).

La digestión de la proteína PAT es iniciada por proteasas, principalmente pepsina, que es secretada por las células epiteliales del estómago. La función de estas proteasas se optimiza a pH muy ácidos (1-2). La hidrólisis de las proteínas produce una mezcla de péptidos y aminoácidos, lo cuales a su vez son potentes estimuladores de la acción gástrica (Alpers, 1987). El estómago tiene un tiempo medio de clareo para líquidos de 12-64 minutos. Para sólidos el intervalo es de 45-195 minutos (Yamada, 1991). El contenido del estómago pasa a los intestinos, donde existen múltiples proteasas con un amplio intervalo de acción. Las proteínas no son absorbidas de manera completa, pero si son absorbidos los péptidos y aminoácidos producto de su degradación (Alpers, 1987; Fuchs et al., 1993).

Las proteínas que no son digeridas fácilmente pueden ser absorbidas en pequeñas cantidades y pueden actuar como antígenos desencadenando respuestas alergénicas. Ejemplos comunes de esto son la caseína en la leche y el gluten del trigo, ambas enzimas son relativamente resistentes a la digestión enzimática (Alpers, 1987).

La susceptibilidad a la degradación de la enzima PAT a la digestión por enzimas proteolíticas fue evaluada en fluido gástrico simulado (FGS). Los resultados indican que PAT se degrada de manera bastante rápida, con un tiempo de vida media demasiado corto como para poder determinarlo, el fluido gástrico contiene la misma cantidad de pepsina que en el fluido gástrico real. Para poder determinar el tiempo de vida media fue necesario diluir 1:1000 la concentración de pepsina, bajos estas condiciones, el tiempo de vida media fue de 1-2 minutos. Estos datos indican que la digestión de PAT es demasiado rápida y se completa en el estómago, por lo tanto el potencial de que presente efectos alergénicos es nulo.

1.17.3 Evento parental MIR162

Los potenciales de toxicidad y alergenicidad de las proteínas Vip3Aa20 y PMI expresadas en el evento de maíz MIR162 fueron evaluados por estudios de toxicidad oral aguda, dinámica digestiva, y estudios de estabilidad térmica. Asimismo, se realizaron búsquedas de homologías de secuencias de aminoácidos respecto de toxinas y alérgenos conocidos con las proteínas Vip3Aa20 y PMI.

La susceptibilidad de la proteína Vip3Aa20 a la degradación proteolítica se evaluó en líquido gástrico simulado (SGF) de mamíferos que contenía pepsina, no detectándose Vip3Aa20 intacta (aproximadamente 89 kDa) luego de la digestión de la Vip3Aa20 derivada de las sustancias de prueba (de maíz y microbiana) en SGF durante un minuto según el análisis de SDS-PAGE, ni fragmentos inmunorreactivos restantes en los análisis de inmunoelectrotransferencia Western. Además, se observó un producto de degradación de bajo peso molecular (ca. 8 kDa) en los análisis de inmunoelectrotransferencia Western de ambas sustancias de prueba, durante un minuto de incubación en SGF. La abundancia de este producto intermedio de digestión disminuyó significativamente durante el tiempo que duró el experimento, indicando así la susceptibilidad a la digestión por pepsina.

© 2013 Syngenta Agro S.A. de C.V. y Syngenta Seeds, Inc. Todos los derechos reservados.

fácilmente como una proteína alimenticia convencional bajo condiciones gástricas típicas en mamíferos.

En cuanto a la proteína PMI, ésta no produjo efectos adversos en los ratones que fueron alimentados con una sola dosis de la proteína (3080 mg / kg de peso corporal). La proteína PMI se degradó rápidamente tras la exposición a pepsina (líquido gástrico simulado), lo que indica que la proteína presente en la dieta será digerida fácilmente como cualquier otra proteína convencional presente en la dieta humana o animal. Además, tanto la proteína PMI como la proteína Vip3Aa20 perdieron actividad enzimática y biológica cuando se incubaron a 65°C durante 30 minutos.

Ni la proteína Vip3Aa20 ni la proteína PMI mostraron homologías significativas en sus secuencias de aminoácidos que fueran similares a las secuencias de toxinas o alérgenos conocidos y que fueran biológicamente relevantes o que tuvieran implicaciones para el potencial alergénico. Con base en las evidencias para la toxicidad y alergenicidad de las proteínas Vip3Aa20 y PMI, se llegó a la conclusión de que las proteínas expresadas en el evento de maíz MIR162 no representan un riesgo para los mamíferos referente a su posible toxicidad o alergenicidad.

1.17.4 Evento parental MIR604

La susceptibilidad de la proteína Cry3A modificada (mCry3A) a la degradación proteolítica se evaluó en líquido gástrico simulado (SGF) de mamíferos que contenía pepsina, no detectándose mCry3A intacta (aproximadamente 67.700 Da) luego de la digestión de la mCry3A derivada de las sustancias de prueba (de maíz y microbiana) en SGF durante dos minutos según el análisis de SDS-PAGE, ni fragmentos inmunoreactivos restantes en los análisis de inmunoelectrotransferencia Western. Respecto del efecto de la temperatura en la proteína mCry3A, se determinó que la incubación de la proteína a 95 ºC durante 30 minutos la inactivaba básicamente. Asimismo, se conoce que los enlaces de disulfuro entre residuos de cisteína pueden estabilizar algunas proteínas y parecen contribuir a su alergenicidad, como lo evidenció el efecto mitigante de la tiorredoxina del agente reductor en la alergenicidad de la leche y el trigo (Buchanan et al., 1997; Del Val et al., 1999). La estructura tridimensional de la proteína Cry3A nativa no incluye enlaces de disulfuro (Li et al., 1991); por lo tanto, es muy poco probable que la proteína mCry3A se estabilice mediante enlaces de disulfuro. La secuencia de aminoácidos de la proteína mCry3A contiene sólo tres residuos de cisteína, la misma cantidad que la proteína Cry3A nativa. La escasa probabilidad de enlaces de disulfuro dentro de la molécula de mCry3A, además de su labilidad térmica y de procesamiento, e inactivación en líquidos gástricos, sugiere que la proteína mCry3A no presenta características que contribuyan a una alta estabilidad y, supuestamente, a un mayor potencial alergénico

1.17.5 Evento parental GA21

El gen mepsps codifica la proteína mEPSPS, la cual confiere tolerancia a los herbicidas que contienen glifosato. Las proteínas EPSPS son ubicuas en la naturaleza y por lo tanto estarán naturalmente presentes en los alimentos que deriven de fuentes vegetales y microbianas. Esta proteína es degradada rápidamente en ensayos de digestibilidad in vitro (Graser, 2005). También es sensible al calor y al procesamiento (Kramer 2005; Hill 2005), por lo que no se esperan

productos de degradación diferentes de aquellos que normalmente se encuentran en procesos proteolíticos en la naturaleza.

1.18 Secuencia nucleotídica de las secuencias reguladoras incluyendo promotores,