La enterotoxicidad inherente de CT ha limitado su uso generalizado como componente de vacunas y como adyuvante, lo cual ha llevado a buscar estrategias que involucren mutantes no tóxicos y subunidades B purificadas.
Varios estudios empleando diferentes condiciones y vías de administración han descrito que CTB posee varias propiedades inmunomoduladoras, abriendo numerosas perspectivas para futuras aplicaciones terapéuticas y biotecnológicas. En este sentido, la inmunización intranasal de mujeres con CTB dio como resultado la producción de anticuerpos anti-CTB IgG e IgA de larga duración en el suero, secreciones nasales y vaginales, de manera dosis- dependiente (25).
CTB recombinante se ha utilizado con éxito como adyuvante de mucosas en vacunas para uso humano, como la propia vacuna del cólera (213), y la vacuna contra la bacteria E. coli
enterotoxigénica que causa diarrea (202, 212). Análogamente, CTB ha demostrado ser buen adyuvante para una vacuna celular de Streptococcus pneumoniae cuando se la administra por vía intranasal en ratones (165).
Otra manera de utilizar CTB como adyuvante es en construcciones genéticas basadas en la toxina y antígenos heterólogos. En general, estas moléculas híbridas se componen de antígenos fusionados al extremo amino (149, 238) o carboxilo (139, 256) terminal de CTB, siendo la unión a GM1 mucho más eficiente en el último caso (160). Algunos ejemplos incluyen la ácido glutámico descarboxilasa (88) y la cadena B de la insulina humana (224). Hay muchos estudios que muestran la inducción de una respuesta inmune mediante la inmunización de ratones con CTB fusionada a antígenos solubles expresados tanto en bacterias (152, 156, 241, 247) como en plantas transgénicas (130, 168). En todos los casos descriptos hubo generación de anticuerpos IgG e IgA específicos contra el antígeno y, en algunos casos, protección. Algunos ejemplos de la acción adyuvante de CTB se muestran en la Tabla IX.
El mecanismo de la actividad adyuvante de CTB todavía no está claro pero se lo ha relacionado con: 1) la inducción del aumento de la permeabilidad del epitelio intestinal, lo cual conduce a la absorción mejorada de antígenos administrados conjuntamente a la toxina; 2) la inducción de una presentación de antígenos más eficiente por diversas APC; 3) la promoción de la diferenciación de isotipo en las células B que conduce a la formación de un aumento de IgA; y 4) exhibición de efectos estimulatorios e inhibitorios sobre la proliferación de células T y
la producción de citoquinas. Entre estos efectos, los que conducen a un aumento en la presentación de antígenos son probablemente de mayor importancia (229). La polaridad de la respuesta inmune generada por CTB es cuestión de debate. Algunos estudios in vitro indican que CTB promueve un fenotipo Th2, con producción de interleuquinas IL-4 , IL-5, IL-6 e IL-10, pero poco IFN- (37, 145, 262), mientras que en otros estudios induce una respuesta tipo Th1 (8, 67). Por otra parte, CTB aumenta notablemente la presentación de antígenos por parte de las CD, los macrófagos y las células B (83). Además, CTB regula la expresión de moléculas coestimuladoras, así como de receptores de quimioquinas, tanto en CD murinas y humanas, entre otras APC (48, 80). Por otra parte, provoca la depleción de la población de linfocitos CD8+ intraepiteliales (75) e induce la diferenciación de isotipo de las células B que actúan de
forma sinérgica con IL-4 (226). El mecanismo de acción propuesto para CTB se grafica en la
Figura 12.
En este trabajo de Tesis se ha intentado aprovechar la excelente capacidad de CTB como adyuvante de mucosas para presentar antígenos de B. pertussis al sistema inmune de mucosas utilizando la ruta de inmunización intranasal. Posteriormente, se ha evaluado la respuesta inmune y protectora generada por los mismos y la factibilidad de la utilización de la vía intranasal y la incorporación de nuevos inmunógenos en el desarrollo de nuevas vacunas acelulares contra la tos convulsa.
Tabla IX. Antígenos hacia los cuales CTB tiene actividad adyuvante.
Antígeno Vía de inoculación Administración de
CTB Referencia
Pro
teín
as
Nucleoproteína del
virus Influenza A IN Co-administrada (96)
Antígeno de superficie de Hepatitis B IN Co-administrada (127) Proteína de Malaria MSP4 5 Oral Co-administrada (257) OVA IM Co-administrada (220) HIV-gp41 SL Conjugado químicamente (113) Epitopes de la glutatión-S IN Genéticamente fusionado (154)
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IN: intranasal, IM: intramuscular, SL: sublingual, SC: subcutáneo, IG: intragástrico
transferasa de Schitosoma mansoni
Po
lis
ac
árido
Polisacárido capsular tipo III de Streptococcus pneumoniaeIN, oral, rectal y vaginal Quimicamente conjugado/ co- administrado (234) Lipopolisacárido de
Vibrio cholerae O1,
serotipo Inaba SC Quimicamente conjugada (97) Polisacárido de pseudomona aeruginosa Oral Co-administrada (2)
M
icro
o
rga
n
ism
o
s
Virus del sarampión IN, IG Co-administrada (190)
Virus influenza IN Co-administrada (271)
Figura 12. Mecanismo de acción propuesto para CTB como adyuvante de mucosas. CTB induce un aumento de la permeabilidad del epitelio intestinal que conduce a 1) una mejor captura de antígenos co-administrados y 2) un aumento de la presentación de antígenos por varias APC. 3) Causa la depleción de la población de linfocitos CD8+ que pueden producir citoquinas inhibitorias, e 4) induce la maduración y la movilización de DC. Además, 5) CTB promueve una fuerte respuesta Th2, y puede 6) inducir o inhibir una respuesta Th1. Por otra parte, 7) CTB induce además una respuesta del tipo Th17. Finalmente, 8) las células epiteliales de la mucosa contribuyen a la actividad adyuvante de CTB al secretar quimoquinas y actuando en leucocitos polimorfonucleares, macrófagos, eosinófilos y células T.
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Contexto
Hemos visto que la tos convulsa es una enfermedad aguda, respiratoria y altamente contagiosa que a pesar de ser inmunoprevenible, hoy en día es considerada una enfermedad resurgente. Surge entonces la necesidad de aplicar refuerzos de inmunización de forma de prolongar la duración de la inmunidad contra la enfermedad, así como también de mejorar las vacunas actuales de manera tal que no solo ofrezcan una protección duradera en el tiempo sino que también protejan contra cepas circulantes antigénicamente distintas. Es por esto que la inclusión de antígenos expresados por cepas circulantes en las formulaciones vacunales podría ofrecer una mejora en el control de esta enfermedad
Por otra parte, ante las vacunas parenterales convencionales, una vacuna mucosal podría ser una alternativa válida para mejorar las vacunas existentes, ya que imita a la infección natural y puede prevenir la colonización de B. pertussis mediante la generación de anticuerpos en la mucosa. Sin embargo, la inducción de una respuesta inmune protectora es difícil de lograr mediante inmunización por vía mucosal con antígenos recombinantes solubles. Es por ésto que el uso correcto de adyuvantes es fundamental a la hora de diseñar vacunas recombinantes administradas por vía de mucosas. En este sentido, se ha demostrado que la subunidad B de la toxina colérica es un potente inmunoestimulador que puede actuar como adyuvante estimulando la respuesta inmune sistémica y de mucosas contra antígenos administrados por vía mucosal, además de ser seguro para su uso en humanos.
Con el objetivo de contribuir al desarrollo de una vacuna recombinante acelular para la mejora de la prevención de la infección por B. pertussis, planteamos los siguientes objetivos generales y específicos:
Objetivo general e hipótesis de trabajo
El propósito general de este trabajo fue generar herramientas moleculares que resulten útiles en el control de la infección causada por B. pertussis.
Nuestro trabajo contempló la identificación, caracterización, y la validación de proteínas de B. pertussis como candidatos vacunales así como el estudio de la respuesta del huésped a dichas proteínas. Nuestra hipótesis es que proteínas recombinantes de B. pertussis fusionadas con CTB son buenos candidatos vacunales para ser utilizados por vía mucosal.
De esta manera, en este trabajo utilizamos a la vía de inmunización intranasal como ruta de administración de los inmunógenos, y CTB como adyuvante mucosal. En particular se realizó la construcción de 3 formas quiméricas en fusión con la notablemente inmunogénica subunidad B de la toxina colérica, tomando ventaja de un vector de expresión (generado por otros investigadores) y el estudio de su valor como herramienta preventiva.
Basándonos en la hipótesis que afirma que la disminución de la eficacia y de la inmunidad inducida por las vacunas aP es causada por la presión de selección y variación antigénica,
que permiten que las cepas circulantes de B. pertussis escapen de la inmunidad inducida por los antígenos presentes en las vacunas aP, como primera estrategia utilizamos como candidatos vacunales a inmunógenos expresados por aislamientos clínicos de B. pertussis, pero no por las cepas utilizadas en las vacunas actuales. El criterio de selección de estos candidatos se basó en los resultados de trabajos previos realizados por otros grupos de investigación, incluyendo el nuestro. Los resultados de esta primera parte del trabajo están descriptos en el Capítulo II.
La segunda estrategia empleada tiene su base en la hipótesis que sostiene que la resurgencia de la tos convulsa es debida a una pérdida de la inmunidad adquirida por infección o
vacunación, lo cual hace que adolescentes y adultos se vuelvan una fuente de contagio para
los niños más susceptibles. En esta segunda estrategia ensayamos la inmunización intranasal para imitar la infección natural y generar una respuesta protectora comparable o superior a la inducida por la inmunización por vía sistémica. De esta manera, en el Capítulo III de esta tesis evaluamos la capacidad protectora de un antígeno incluído actualmente en las formulaciones actuales de las vacunas acelulares, y estudiamos si el cambio en la vía de inmunización y la utilización de CTB son eficientes en la generación de una respuesta inmune protectora superior.
Por lo tanto, en el Capítulo II se han incluido dos candidatos expresados por cepas de B. pertussis pertenecientes a aislamientos clínicos (Bsp22 y LpdA), mientras que en el Capítulo III estudiamos como candidato vacunal a un inmunógeno conocido, la fimbria (Fim2), presente en las formulaciones vacunales actuales.
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Objetivos específicos
Los objetivos especificos abordados en este trabajo de tesis fueron los siguientes:
1. Clonar los ORF codificantes para las proteínas Bsp22, LpdA, y Fim2 de Bordetella pertussis en el vector de expresión pAE-ctxB.
2. Expresar las proteínas recombinantes CTB-Bsp22, CTB-LpdA y CTB-Fim2 en una cepa de expresión de Escherichia coli adecuada.
3. Purificar las proteínas recombinantes por cromatografía de afinidad.
4. Caracterizar las proteínas recombinantes con anticuerpos anti-CTB.
5. Obtener las proteínas recombinantes en su estado de plegamiento correcto y verificar su unión al gangliósido GM1.
6. Inmunización y desafío con una cepa adecuada de Bordetella pertussis patogénica.