PROTEÓMICA

La Proteómica es una disciplina comparativa que identifica y caracteriza aquellas proteínas que diferencian, a nivel de expresión o de modificación química o estructural, la célula o el tejido enfermo del sano. Esas proteínas diferenciales serán los marcadores con los que se pueda llegar a desarrollar métodos de predicción, diagnóstico, pronóstico o respuesta a fármacos de la enfermedad en estudio; esas proteínas diferenciales también podrán ser candidatas a dianas terapéuticas.

La proteómica es la nueva etapa en la investigación biológica que emana naturalmente de la genómica y que incluye la caracterización de la expresión de las proteínas codificadas por un genoma y el establecimiento de sus propiedades funcionales y estructurales. (Anderson 1998).

Ni la estructura primaria del gen ni la del RNAm ni de la proteína misma dan indicaciones claras de la naturaleza del producto proteico ni de su función; por lo tanto, la primera tarea de la proteómica consiste en identificar las proteínas producidas por un genoma. Es decir, principalmente problemas tecnológicos frente a cómo se pueden separar y visualizar las proteínas en un proteoma, cómo se puede utilizar esta información para estudiar complejos proteicos y caminos metabólicos, cómo se pueden identificar proteínas separadas y cómo se pueden caracterizar en detalle tales proteínas.

De este modo, se pueden caracterizar las redes funcionales que establecen las proteínas y su dinámica durante procesos fisiológicos y patológicos. Las proteínas presentan alrededor de 300 diferentes tipos de modificaciones postraduccionales, incluyendo fosforilación, glicosilación, acetilación, y deaminación, entre otras. Estas modificaciones pueden afectar la estructura, localización, función y recambio, e implican funciones reguladas por factores internos y externos a las células, desencadenando procesos de expresión

genética diferencial. Como resultado de estas variaciones se produce la diferenciación celular y pueden originarse determinadas patologías. (Pando 2007).

2.3.1 Proteoma

El proteoma de un organismo representa el total de proteínas expresadas por un genoma. (Thompson et al., 2002). Los proteomás son dinámicos y cambian con el tiempo, con el estadio del desarrollo y con las condiciones intra y extracelulares. El proteoma de una célula varía según el estado en el que se encuentre la célula, si se encuentra en una situación de estrés, bajo el efecto de fármacos o de una hormona. Así, en cada momento y en cada tipo celular el perfil de proteínas expresadas será diferente.

La proteómica es el estudio de los proteomas; separa, identifica y caracteriza proteínas a gran escala, define niveles de proteínas celularmente, investiga complejos de proteínas, elucida funciones, caminos metabólicos e interrelaciones, también se encarga de la caracterización funcional de tales proteínas y de sus relaciones estructurales. (Kenyon 2002).

Existen tres ramas en la proteómica que tratan de caracterizar el proteoma estudiando distintos aspectos del mismo:

1. La proteómica de expresión: se encarga del estudio de la abundancia relativa de las proteínas y de sus modificaciones postranscripcionales 2. La proteómica estructural: se encarga de la caracterización de la

estructura tridimensional de las proteínas

3. La proteómica funcional: se encarga de la localización y distribución sub-celular de proteínas y de las interacciones que se producen entre las proteínas y otras moléculas con el fin de determinar su función

2.3.2. Orígenes de la proteómica

La técnica electroforética es relativamente antigua, fue inventada por Tiselius hace más de 50 años y, en 1956, Smithies y Poulick describieron el primer gel en dos dimensiones, mientras que en 1975, Patrick O‘Farell optimizó el proceso de separación en 2D, técnica que se utiliza hoy en día.

En 1950, el investigador sueco E. Edman desarrolló un método que permite saber el orden de los aminoácidos en una proteína, a la que se conoce como

degradación de Edman. Durante muchos años esta técnica fue de vital

importancia en la investigación bioquímica. La secuenciación parcial de fragmentos proteínicos y el ensamblaje de esta secuencia permitió conocer en forma completa la secuencia de aminoácidos de algunas proteínas.

La posibilidad de identificar proteínas en forma global surge gracias a la modernización de la espectrometría de masas (EM). En 1985, J. Fenn y K. Tanaka desarrollaron los sistemas de ionización de macromoléculas ESI y MALDI respectivamente, por lo que se les galardonó con el Premio Nóbel de Química 2002.

2.3.3 Técnicas proteómicas

Para analizar los proteomas de células o tejidos se han desarrollado un conjunto de nuevas técnicas que se engloban en el término Proteómica. La

Proteómica facilita el análisis cualitativo y cuantitativo de la expresión de las proteínas que existen dentro de una célula. La Genómica analiza el potencial de expresión génica y proteica de un organismo, determinado por su Genoma, pero es la Proteómica la que especifica qué proteínas se expresan en los distintos tipos de células de ese organismo, y en las distintas

situaciones fisiológicas en las que se encuentran esas células, cual es el nivel de expresión de esas proteínas y qué modificaciones post- traduccionales afectan a su estructura y función. (Patterson et al., 2003).

2.3.3.1 Electroforesis bidimensional 2-DE

Dentro de las aproximaciones proteómicas podemos distinguir principalmente dos bloques de técnicas de análisis de proteínas. En el primero se incluyen técnicas en las que las proteínas a estudiar no se separan, por ejemplo, las matrices de anticuerpos y de otras moléculas como alérgenos, glúcidos, otras proteínas, etc. En el segundo bloque se incluyen técnicas que implican una separación de las proteínas, como es el caso de la electroforesis bidimensional (electroforesis-2D) y la cromatografía líquida (LC).

Entre las técnicas que separan las proteínas, la LC está cobrando cada vez más importancia por su utilidad cuando se quieren separar proteínas pequeñas. En esta técnica, las proteínas de la muestra interaccionan con una fase estacionaria de un modo característico, lo que se aprovecha para su separación.

Por otra parte, la técnica de separación de proteínas por excelencia es la electroforesis-2D. En este caso, las proteínas se separan en una primera dimensión en función de su punto isoeléctrico para, posteriormente, separarse ortogonalmente en una segunda dimensión en función de su masa. Esto da lugar a una serie de puntos, cada uno de los cuales corresponde a una proteína. Con esta técnica se pueden separar varios miles de proteínas en un solo gel. Figura número 2.

Figura número 2. Esquema general de la separación de proteínas mediante técnica de 2-DE.

Tanto la LC como la electroforesis-2D requieren otras técnicas para identificar las proteínas separadas, siendo de especial importancia para ello el desarrollo de la MS.

2.3.3.2 Espectrometría de Masas MS

Con esta técnica se puede calcular de forma muy precisa y exacta la masa de las moléculas. La obtención de información de las proteínas mediante MS se puede dividir en 3 etapas:

1. Preparación de la muestra. 2. Ionización de la muestra.

3. Análisis de masas de la muestra.

Inicialmente, las moléculas se volatilizan en forma de iones. A continuación, dichos iones pasan a un sistema analizador de masas en vacío, que usa campos eléctricos (sistemas cuadrúpolos y trampas iónicas) o no (sistemas de tiempo de vuelo), capaz de separar los iones en virtud de su relación masa/carga (m/z). Finalmente, los iones llegan a un detector y se determina su masa gracias a la separación efectuada en el paso anterior.

Existen distintas variantes para la volatilización/ionización de las moléculas, entre las que destacan, por su aplicabilidad a los péptidos y las proteínas, la ionización por electrospray (ESI) y la desorción/ionización mediante láser asistida por una matriz (MALDI).

El método de ionización por electropulverización, ESI (electrospray ionization), permite la ionización de moléculas a partir de flujos líquidos bajo

aplicación de alto voltaje, mientras que la ionización por el método MALDI, produce iones por bombardeo con rayos láser de muestras en estado sólido auxiliado por matrices cristalizables.

En el primer caso (ESI), las moléculas en disolución se hacen pasar por un fino capilar sometido a un intenso campo eléctrico. Así, se obtiene una dispersión de la solución en microgotas en las que el solvente se evapora y las moléculas pasan a la fase gaseosa y adquieren carga.

En el segundo caso (MALDI), las moléculas se mezclan con una matriz sólida absorbente de luz. Sobre esta matriz se hace incidir un láser que provoca la ionización y desorción de las moléculas, que quedan en fase gaseosa. Tras la ionización de las moléculas por un método u otro, éstas se someten a la MS.

Otra técnica utilizada habitualmente en las aproximaciones proteómicas es la espectrometría de masas en tándem (MS/MS). Este método consiste en someter una mezcla de péptidos a una primera MS donde se separan en función de su relación m/z. Con este procedimiento se obtiene una mezcla de «péptidos hijos» que se someten a una segunda MS, lo que da lugar a una "escalera" de tamaños en la que la diferencia entre cada "peldaño" corresponde a un solo aminoácido, lo que permite deducir la secuencia peptídica. Obtenida esta secuencia "real" de la proteína, se puede buscar en las bases de datos a qué proteína "teórica" corresponde.

2.3.3.3 Técnica LC-MS/MS (Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry).

Cromatografía líquida bidimensional que utiliza una columna de intercambio iónico (separación por carga) o una columna de fase reversa (separación por hidrofobicidad). Seguida de análisis de los péptidos mediante MS. Requiere la digestión previa de las proteínas con una proteasa. Este método permite la separación de cientos de proteínas en un solo experimento.

2.3.3.4 Microarrays de proteínas

Las proteínas sufren toda una serie de modificaciones post-traduccionales a lo largo de su proceso de síntesis como: procesamientos proteolíticos,

glicosilaciones y formación de complejos proteicos. Por otra parte, las proteínas han de plegarse correctamente para ser totalmente funcionales. Las proteínas de interés en un proteoma pueden ser expresadas masivamente, purificadas, depositadas e inmovilizadas de manera individual, ordenada e independiente sobre un soporte sólido. Una mezcla compleja (lisado celular o suero) se pasa sobre el microarray para permitir la unión a su correspondiente proteína diana.

2.3.4 Protocolo

Actualmente no existe un diagrama de flujo único para el análisis proteómico de una muestra, ya que las variables como complejidad, método de separación, concentración y estabilidad de las proteínas, además de la plataforma tecnológica disponible para su análisis, y muy especialmente el tipo de pregunta biológica que se pretende abordar, son los parámetros básicos que determinan la elección de una estrategia de estudio.

Sin embargo la metodología general para el análisis proteómico de una muestra se resume en: (Corrales et al., 2006). Figura número 3

1. Recogida y almacenamiento de muestras. Uno de los factores clave en un

experimento de proteómica

2. Extracción y solubilización de las proteínas. Es necesario extraer y

solubilizar las proteínas con la menor contaminación posible de otros biomateriales (lípidos, ácidos nucleicos, etc.).

3. Separación y detección de las proteínas diferenciales. El objetivo es

resolver las complejas mezclas de proteínas de las muestras biológicas combinando diversos procedimientos cromatográficos y electroforéticos. El método de referencia es la electroforesis bidimensional que permite la

4.Separación de las especies peptídicas de acuerdo a su punto isoeléctrico y a su peso molecular.

5. Identificación de las proteínas de interés. La identificación de las proteínas

requiere su digestión con proteasas específicas (la tripsina es la enzima de referencia) y el análisis de los péptidos generados mediante diferentes tipos de espectrómetros de masas.

3. Análisis de resultados mediante programas bioinformáticos.

2.3.5. Bases de datos

La huella peptídica es el conjunto de fragmentos peptídicos que se obtienen tras tratar una proteína concreta con una proteasa determinada. La huella peptídica es característica de cada proteína y depende de la enzima con la que se fragmente. Actualmente hay numerosas bases de datos que recogen las huellas peptídicas de multitud de proteínas conocidas. Estas bases de datos se pueden rastrear usando programas bioinformáticos para buscar la huella peptídica que corresponda con la huella peptídica de la proteína que se esté estudiando y por tanto poder identificarla.

PIM, http://www.hybrigenics.fr Contiene los resultados del análisis por doble- híbrido del genoma de Helicobacter pylori. En el estudio se describieron

1,465 interacciones proteicas anotadas en la base de datos. (Rain et al 2001).

BRITE (Biomolecular Relations in Information Transmisión and Expression), http://www.genome.ad.jp/brite/ Es una base de datos de relaciones binarias y comparación de grafos que involucran genes y proteínas. Contiene interacciones proteína-proteína obtenidas por doble-híbrido en S. cerevisiae

y H. pylori, y por otras extraídas de la literatura científica; interacciones en

vías metabólicas; información sobre similitud de secuencia; y relaciones obtenidas a través de micro-arreglo de ADN.

http://www.mpiib-berlin.mpg.de/2D-PAGE/ es una base de datos que contiene los resultados obtenidos del estudio inmunoproteómico de la cepa 26695 de Helicobacter pylori donde se puede acceder con el nombre o por el

2.3.6. Aplicaciones de la proteómica

1. Las aplicaciones de la proteómica son múltiples, pero actualmente se destacan las siguientes:

2. Identificación de nuevos marcadores para el diagnóstico de enfermedades 3. Identificación de nuevos fármacos

4. Determinación de mecanismos moleculares involucrados en la patogenia de enfermedades

5. Análisis de rutas de transducción de señales