Para comprobarlo, utilizamos un protocolo de administración de BrdU en el que realizamos dos inyecciones intraperitoneales con 2h de diferencia entre sí, tanto en animales control como en animales infectados con el virus a 35 dpi. Transcurridas 22 h desde la última administración, los animales volvieron a someterse al mismo protocolo de administración para asegurar la incorporación del BrdU por el mayor número de células proliferativas posible sin inducir toxicidad al animal, y se les dejó en el
Página | 69 estabulario durante 25 días adicionales, momento en el que fueron sacrificados y procesados para su análisis (Esquema 2).
Como nuestro objetivo era intentar explicar la remielinización observada a 60 dpi, nos centramos en una estructura próxima a la ZSV como era el cuerpo calloso, zona que también presentaba una desmielinización evidente a 35 dpi y una remielinización espontánea a 60dpi en nuestro modelo de estudio (Fig. 15). Con este fin, realizamos un doble marcaje mediante inmunohistoquímica con BrdU y APC (un marcador de oligodendrocitos maduros), 25 días después de la última inyección intraperitoneal con BrdU según el protocolo descrito anteriormente, para lo cual se realizaron cortes coronales del encéfalo y se analizó el número de células BrdU y APC positivas en cuerpo calloso (n= 4 secciones analizadas/animal, desde Bregma 0,50mm hasta - 0,10mm).
Figura 15. Desmielinización y remielinización en el cuerpo calloso de los animales TMEV-IDD. Fotomicrografías de microscopía óptica (20x) representativas de secciones transversales de cuerpo calloso de 30 μm de grosor que muestran la mielina marcada con el anticuerpo CNPasa, tanto en animales control como en animales TMEV-IDD a tiempo 35 y 60 dpi. Siguiendo el mismo patrón que las otras dos estructuras encefálicas analizadas (tronco cerebral y corteza motora), en el cuerpo calloso puede observarse una desmielinización a 35 dpi seguida por una remielinización a 60 dpi cuando se comparan los animales infectados con los animales control.
Como puede observarse en la Fig. 16, el número de células BrdU+ que había migrado hacia el interior del cuerpo calloso era mayor en el caso de los animales infectados con
Página | 70 el virus a 60 dpi, células que además comarcaban en gran parte con el marcador de oligodendrocitos maduros APC. Al realizar el análisis del número de células que habían migrado (Fig. 16b), se pudo comprobar cómo la infección con el virus de Theiler producía un incremento de migración de células BrdU positivas hacia el cuerpo calloso en un ratio de 2.64 veces (p≤0.001), en consonancia con el trabajo de Picard-Riera de 2002 en el que la desmielinización inducida por EAE provocaba la movilización de células desde la ZSV hacia estructuras periventriculares como el cuerpo calloso (Picard- Riera y cols., 2002).
Figura 16. Migración de progenitores y diferenciación a oligodendrocitos maduros en TMEV-IDD. Marcaje de las células derivadas de ZSV en el cuerpo calloso, 25 días después de la administración del BrdU. (a) Fotomicrografías de microscopía confocal (20x) representativas de secciones transversales de cuerpo calloso de 30 μm de grosor que muestran el marcaje con BrdU (verde) y APC (rojo) en animales SHAM y TMEV a 60dpi. (b) Cuantificación del número de células BrdU positivas y (c) BrdU+/APC+ que han migrado hacia cuerpo calloso en animales SHAM y TMEV a 60dpi (fase preclínica tardía). Los datos se representan como media ± error estándar del número de células BrdU+^10 y % de células BrdU+/APC+ de los contajes de 3 animales/grupo con 10 secciones/animal. *p≤0,05; ***p≤0,001vs SHAM.
En este mismo trabajo, la inmunohistoquímica combinada para BrdU y marcadores específicos mostró que las células de la ZSV migraban hacia el cuerpo calloso como progenitores gliales bajo esas condiciones de desmielinización inducida por EAE. En
Página | 71 nuestro caso y de manera similar, las células marcadas con BrdU en la ZSV migraban hacia el cuerpo calloso y se diferenciaban a oligodendrocitos maduros APC+ a los 60 dpi (Fig. 16c), de tal manera que observábamos un aumento significativo en el número de células BrdU+/APC+ en los animales infectados (60.09±7.3%) respecto a los animales control (35.6±5.8%, p≤0.05), que podría explicar la remielinización espontánea observada en los animales TMEV a 60dpi.
Página | 72
2.- EFECTO DEL TRATAMIENTO CON CBD EN LA FASE CRÓNICA (TERAPÉUTICA) E INDUCTORA EN EL MODELO TMEV-IDD.
Página | 73 Trabajos previos del laboratorio han descrito el efecto terapéutico de la administración de cannabinoides o la modulación del sistema endocannabinoide en el modelo de TMEV-IDD (Mestre y cols., 2005; Docagne y cols., 2007; Loria y cols., 2008; Mestre y cols., 2009; Loria y cols., 2010). Dicho efecto beneficioso ha sido relacionado con las propiedades inmunomoduladoras, antiinflamatorias y protectoras de estos compuestos en términos de mejora en la actividad y coordinación motora, disminución de reactividad microglial, disminución de expresión de antígenos de MHC-II y de infiltrados linfocitarios CD4+ y CD8+, disminución en moléculas de adhesión y protección frente a la neurodegeneración, entre otros.
Además, se ha descrito en la literatura que el CBD, uno de los derivados de Cannabis sativa sin efectos psicoactivo, es un buen candidato para el tratamiento terapéutico de enfermedades con componente inflamatorio (Mechoulamn y cols., 2007) y neurodegenerativo (Iuvone y cols., 2009). En el caso concreto de la EM, está aprobado el uso del fármaco Sativex® (compuesto por THC y CBD en proporción 1:1) para el tratamiento de la espasticidad y el dolor neuropático derivados de la enfermedad.
Con todos estos antecedentes, nuestro siguiente paso fue evaluar el efecto del tratamiento in vivo del CBD en el modelo TMEV-IDD, en dos puntos de acción concretos: fase crónica y fase aguda. La valoración de parámetros como la función motora y el efecto inmunomodulador del CBD (en términos de expresión de citoquinas proinflamatorias, quimioquinas, marcadores de activación microglial e infiltrados inflamatorios) quedan descritos en los resultados que se detallan a continuación.
Esquema 3. Protocolos de tratamiento con CBD en las dos fases de estudio de la enfermedad