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PROTOCOLO AISLAMIENTOS Concentración de
ADN mg/mL GRADO DE PUREZA (Relacion 260/280) ng/ μL Liu y col., 2000 TC 45.3 1.448 TA1 19.35 1.577 TA2 106 1.413 TS1 112.2 1.648 TS4 99.7 1.591 Chang-Bhatnagar, 1995 TC 15.4 2.264 TA1 10.5 2.082 TA2 8.9 2.954 TS1 12.8 2.365 TS4 8.2 2.543 Paterson y Bridge,1994 TC 13.6 1.696 TA1 6.1 1.692 TA2 8.15 1.767 TS1 13.8 1.845 TS4 9.1 1.734
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Y COMUNICACIÓN
DISCUSION
Con respecto al pH obtenido de los suelos de cultivo de caña de azúcar en la localidad de Virú, se obtuvieron resultados que se encontraban entre 7 y 8. Según kavanagh, 2005 un pH optimo del suelo para el desarrollo de Trichoderma spp.se encuentra entre 4 y 6, por ello un pH elevado como el encontrado en el presente trabajo perjudica la solubilidad de los metales, afectando de tal forma el crecimiento del hongo; por otro lado un pH bajo afecta la presencia enzimática, la absorción de vitaminas, ácidos orgánicos y de minerales. La temperatura y el pH son factores importantes en el aislamiento microbiano, debido a que estas condiciones estimulan o inhiben el crecimiento de la flora de interés. (Cochrane, 1963). Por ello solo se pudieron aislar pocas especies de Trichoderma spp., sin embargo éstas alcanzaron grandes niveles de antagonismo y rápido crecimiento.
El procesamiento de las muestras se realizó a una temperatura que no afectó el metabolismo de los microorganismos, trabajando con condiciones similares a las de los campos de cultivo de Virú, sin afectar la proliferación fúngica. Por ello los aislamientos fueron incubados a 25°C, debido a que según Arias y Piñeros, 2008; esta temperatura es la ideal para el desarrollo de Trichoderma spp. reactivando su esporulación.
Alexander, 1980 refiere que el suelo está compuesto por: minerales, agua, aire, materia orgánica, etc los cuales determinan el tipo de suelo del que se trata, de acuerdo a la variación de sus cantidades según la localidad. En cuanto al tipo de suelo encontrado: franco-arenoso, está conformado por: arena (0.02 a 2 mm), limo (0.002 a 0.02 mm) y arcilla (menos de 0.002 mm de diámetro) que determinan la textura del suelo de Virú, la cual es un factor importante en la capacidad de retención del agua y nutrientes necesarios para el desarrollo de Trichoderma spp. (Valencia y Cabriales, 2001).
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Las colonias desarrolladas, presentaron colores blanquecinos al inicio, para luego de unos días virar a colores verduscos; presentando micelio algodonoso o plano y pigmentaciones en el envés de la placa o incoloro como refiere Infante, 2009. Todas los aislamientos de Trichoderma nativas, presentaron un crecimiento rápido, ocupando gran parte de la placa petri a los 8 días (mayor a 5 cm). A través de la medición realizada diariamente, se observó que la cepa comercial TC de T. virens es las más lenta en crecimiento, probablemente debido a que esa especie no es autóctona, por lo tanto no soporta las condiciones medioambientales de Virú, como es el caso de los aislamientos nativos(Agrios,2005). El aislamiento TS4 de T. koningii muestra la mayor velocidad de crecimiento, seguida del aislamiento TS1 de T. harzianum.
La presencia del fitopatógeno Fusarium moniliforme en confrontación con Trichoderma
spp aceleró el crecimiento de algunos aislamientos nativos, uno de ellos es el caso del asilamiento TS4, debido a la liberación de alguna sustancia por parte del hongo fitopatógeno, hecho estudiado por Rocha et. al., 2002; Nawar, 2005 quienes destacan la estimulación que recibe Trichoderma al reconocer las lectinas unidas al patógeno. Por otro lado también se evidenció una disminución del crecimiento de TC correspondiente a
T. virens frente a Fusarium moniliforme. Esto puede ser atribuido a la producción de metabolitos por parte de Fusarium moniliforme que inhiben el crecimiento de
Trichoderma sp, siendo entonces la cepa TC la más susceptible de todas las cepas a la presencia de estos metabolitos (Mumpuni et. al., 1998).
Asi mismo, el crecimiento de los fitopatógenos también se ve afectado por la presencia de Trichoderma spp, que puede ocasionar inhibición del crecimiento, como en el caso del
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patógeno por los aislamientos de TS1 y TS4. Guigon y González, 2004 observaron que
Trichoderma spp parasita las hifas de Phytophthora capsici, reduciendo su crecimiento hasta un 50%. Martínez et. al., 2008 atribuyen que la excreción de metabolitos, con efectos antifungicidas al medio de cultivo delimita el crecimiento del patógeno. Con respecto, a los fenómenos de antagonismo, se obtuvo que varios aislamientos de
Trichoderma spp no permiten el crecimiento de las colonias de Fusarium moniliforme, siendo así cepas indicadas para su aplicación en campo, una de ellas es T. harzianum,
hongo altamente competitivo en suelos según lo indica Wardle et. al., 1993.
La liberación de antibióticos en el medio de cultivo por parte del antagonista puede ocasionar espacios de ausencia de crecimiento como lo observado en el enfrentamiento del patógeno con la cepa TA2. Sivasithamparam y Ghisalberti ,1998 reportan sustancias responsables de este fenómeno, producidas por Trichoderma spp con propiedades antifúngicas. En 1983, Howell y Stipanovic, aislaron y describieron un antibiótico llamado gliovirina de Trichoderma virens que demostró gran potencial inhibitorio para
Pythium ultimum y Phytophthora spp.
El efecto macroscópico del hiperparasitismo, en Fusarium moniliforme se observó en el aislamiento TS4, en donde Trichoderma sp. es capaz de crecer sobre el patógeno, llegando a estrangular las hifas de este último e impidiendo su desarrollo. Este fenómeno se ha evidenciado en diversos fitopatógenos tanto en condiciones in vitro como in vivo, siendo actualmente el mecanismo de antagonismo más efectivo (Harman et. al., 2004b; Mukherjee et. al., 2004; Cardona y Rodríguez, 2006; Djonović et. al. ,2006; Djonović et. al., 2007). Ezziyyani et.al 2004, observaron que T. harzianum es capaz de hiperparasitar
Phytophthora capsici y reducir la colonia del fitopatógeno en menos de 1 semana.
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Srilakshmi et. al., 2001 reportan que especies de Trichoderma spp desarrollan micoparasitismo sobre la especie Aspergillus flavus. Las características microscópicas encontradas de cada cepa fueron muy similares entre si, diferenciándose solo en pocos aspectos, pero aún así permitiendo su identificación de acuerdo a la disposición de las fiálides, y a la forma y color de las conidias reportado por Samuels etal, 2013.
La concentración e integridad del ADN extraído, se verificaron mediante electroforesis en geles de agarosa. La electroforesis consiste en la separación de moléculas (ácidos nucleicos) a través de una matriz tamponada (agarosa). La matriz funciona como un filtro, separando las moléculas en un campo eléctrico, de acuerdo al tamaño y la carga neta que poseen. En el caso de los ácidos nucleicos, el grupo fosfato es el responsable por la fuerte carga negativa en condiciones de pH neutro, haciendo que los fragmentos migren hacia el polo positivo (ánodo) durante la electroforesis (Posso y Ghneim 2008).
Los ácidos nucleídos separados en geles de agarosa pueden visualizarse mediante tinción con colorantes fluorescentes, lo cual permite evaluar su integridad y estimar su concentración mediante un análisis comparativo con patrones de concentración conocida. Los colorantes fluorescentes actúan mediante inserción entre las pares de bases que conforman el ácido nucleíco. El bromuro de etidio es ampliamente utilizado para la visualización de ADN y ARN (Posso y Ghneim 2008).
Con respecto a la extracción de ADN se obtuvieron mejores resultados utilizando fenol para la eliminación de proteínas, de igual forma el acetato de sodio es una sal importante para la precipitación de proteínas desnaturalizadas, evitando de esta manera la contaminación con nucleasas, las cuales interfieren en el corrido electroforético
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produciendo bandas tenues, al no ser bien purificadas (Boom, 1990). El protocolo de Paterson y Bridge, 1994 generó bandas de ácidos nucleicos más limpios, ya que utilizan polivinilpirrolidona (PVP) como oxidante y b-mercaptoetanol en el buffer de extracción para reducir los polifenoles. Boom, 1990 destaca la importancia de utilizar PVP ya que elimina las polifenoloxidasas presentes en algunos tejidos que provocan coloración parda o gris en ADN extraído, así mismo el poder antioxidante del b-mercaptoetanol. Por otro lado la utilización de ARN asa y de lavados con etanol al 70 % asegura la ausencia de arrastre en el corrido electroforético (Boom, 1990).
El protocolo propuesto por Paterson y Bridge, 1994 resultó ser el más apropiado al hacer la modificación en la utilización de reactivos como el ARNasa, etanol al 70 %, polivinilpirrolidona (PVP) y b-mercaptoetanol, garantizando de tal forma un corrido electroforético con bandas nítidas y sin arrastre oxidante (Valadez, 2000). La calidad del ADN puede ser estimada por la electroforesis en gel de agarosa. La ausencia de bandas o muy débiles, se puede deber a la poca cantidad de muestra cargada, o a la contaminación por nucleasas. Mientras que el material parcialmente degradado, forma un barrido (parecido a una mancha) de fragmentos pequeños, haciendo que la definición de la banda pierda su nitidez o no se aprecie (Valadez, 2000), probablemente debido al aún contenido alto de sales, a la contaminación por proteínas y a la desnaturalización del ADN, como lo indica Rogers, 1988.
El estado de pureza del ADN se ve reflejado en la relación entre la Absorbancia a 260 nm y la Absorbancia a 280 nm, si este valor se encuentra entre 1.7 a 2.0 ng/ μL como en el protocolo de Paterson y Bridge,1994 el ADN obtenido se encuentra libre de contaminantes celulares que interfieren con su pureza; valores inferiores a 1.7 ng/ μL,
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como los obtenidos en el protocolo de Liu y col, 2000 indican contaminación con proteínas, fracciones de membranas o fenol y valores por encima de 2 ng/ μL, como los obtenidos con el protocolo de Chang-Bhatnagar, refleja la presencia de ARN disperso. (Müller y Schweizer, 1994)
La contaminación del ADN por proteínas o por compuestos utilizados para la extracción de ADN pueden interferir absorbiendo la radiación UV, de tal forma que la cantidad de ADN determinada por espectrofotometría se sobreestima (Valadez, 2000), como lo sucedido con el protocolo de Liu y col., 2000 donde se obtuvieron valores entre 45 a 112 mg/ ml
Se logró determinar que la calidad de ADN obtenida por cada protocolo utilizado, presentaron diferencias significativas (p < 0.05), y al realizar el análisis de post-anova (Tukey) se determinó entre qué protocolos existía diferencias significativas, siendo el caso el del protocolo de Liu, 2000 con respecto a los protocolos de Chang-Bhatnagar, 1995 y Paterson, 1994. Esto debido a que si bien no hay diferencias significativas entre los protocolos de Chang-Bhatnagar, 1995 y Paterson, 1994; la utilización de otros agentes purificantes garantiza la obtención de una mejor calidad de ADN para ser destinado posteriormente para estudios de identificación molecular.
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CONCLUSIONES
El suelo del cultivo de caña de azúcar en la localidad de Virú presenta escazas cantidades de aislamientos de Trichoderma spp., por lo que se lograron aislar solo 4 especies con potencial antagónico.
Los 4 aislamientos nativos obtenidos del suelo de Virú podrían ser candidatos para ser utilizados en campo como agente de control biológico contra Fusarium moniliforme, ya que ninguno es limitado en su crecimiento por estos fitopatógenos.
Los 4 aislamientos evaluados lograron ser identificados morfológicamente, siendo aislamiento TS4 correspondiente a T. koningii la que presentó mayor tasa de crecimiento (1.3 cm/día en promedio), así como también la mayor capacidad antagónica (grado 1) frente a Fusarium moniliforme.
El protocolo de Paterson y Bridge,1994es ideal para estudios posteriores de identificación molecular y filogenia.
Dados los resultados obtenidos en este trabajo, es posible continuar con la caracterización molecular de Trichoderma spp.
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RECOMENDACIONES
Realizar estudios evaluando diferentes temperaturas de incubación en el momento del aislamiento para lograr condiciones similares a los de Virú.
Se recomienda llevar a campo el ensayo de acción inhibitoria in vitro, de Trichoderma spp contra el patógeno Fusarium moniliforme causante de la enfermedad de la marchitez y pudrición en cultivos de caña de azúcar.
Complementar la identificación de hongos por medio de otras técnicas como el análisis de ácidos grasos y métodos basados en ADN y ARN.
Realizar pruebas de antagonismo en otras especies de fitopatógenos de importancia agrícola.