PROTOCOLOS DE TRABAJO CON PROTEÍNAS 1 Anticuerpos utilizados.

Anticuerpos primarios:

o Anti-GPAT2: reconoce específicamente la isoforma 2 de GPAT y cruza con las

isoformas de humano, rata y ratón (Sigma). Se utilizó en una dilución 1/500 en leche descremada al 1% p/v en PBST para Western blot y 1/35 para inmunohistoquímica.

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o Anti-GAPDH: producido en ratón contra la región entre los aminoácidos 1-335 de

la isoforma humana, cruza con GAPDH de rata y ratón (Santa Cruz Biotechnology). Se utilizó en una dilución 1/5000 en leche descremada al 1% p/v en PBST.

o Anti-βActina: producido en conejo contra el segmento de 1-100 aminoácidos de

la isoforma humana, cruza con las isoformas de rata, ratón, oveja, vaca, perro, entre otros. Se utilizó en una concentración 1/5000 en leche descremada al 1% p/v en PBST (Santa Cruz Biotechnology).

Anticuerpos secundarios:

o Anti-IgG de conejo conjugado a peroxidasa: anticuerpo policlonal comercial

(Pierce), diluido 1/5000 en leche descremada al 1 % p/v.

o Anti-IgG de ratón conjugado a peroxidasa: anticuerpo policlonal comercial

(Pierce), diluido 1/5000 en leche descremada al 1 % p/v.

7.2. Identificación de proteínas por Western blot.

7.2.1. Obtención de homogenatos de testículo de ratón.

Se extrajo el órgano y se sumergió en buffer H suplementado con un 0,002% v/v de cocktail inhibidor de proteasas (Sigma), en hielo. La cantidad de buffer H agregada dependió del peso del tejido, manteniendo una relación de 5 ml/gramo. El tejido se disgregó mecánicamente con un homogeneizador de vidrio/teflón tipo Potter utilizando un sistema motorizado (Tri-R Instruments, 1000 rpm). Se utilizaron varios ratones para la confección de la curva de edad, procesando los testículos de cada edad en simultáneo.

7.2.2. Cuantificación de proteínas.

Se utilizó el método de Bradford [77], el cual se basa en el cambio de color del colorante Comassie Brilliant Blue G-250 en presencia de distintas concentraciones de proteínas. La interacción del colorante con aminoácidos básicos y aromáticos provoca un cambio en su máximo de absorción, de 465 a 595 nm (rojo y azul, respectivamente). Para determinar la concentración de proteínas de una determinada muestra, se realizaron diluciones 1/100, 1/50 o 3/33 y, en paralelo, una curva de calibración con albúmina 1mg/ml. Luego de agregar el reactivo de Bradford a la muestra, se incubó 5 minutos a temperatura ambiente y luego se leyó su absorbancia en las dos longitudes de onda en un lector de placas DTX 880 Multimode Detector (Beckman Coulter). Luego se restó Abs 594nm-Abs 465nm y con ese valor se construyó la curva de calibración y se determinó la concentración de proteínas de las muestras. Sólo se utilizaron los valores de las muestras problema cuyo valor estuviera dentro de los límites de la curva de calibración.

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7.2.3. Separación de proteínas en geles de poliacrilamida.

Para la separación de las proteínas de una muestra en función de su tamaño se utilizó un gel de poliacrilamida, en presencia del detergente aniónico dodecilsulfato de sodio (SDS). El método fue descripto por Laemmli [78] e implica una desnaturalización previa de las proteínas por calor y en presencia de β-mercaptoetanol y SDS (se rompen los puentes disulfuro, se interrumpen las interacciones débiles y la proteína se carga negativamente) para luego separar las distintas cadenas polipeptídicas en función de su tamaño a través de un gel al 10-15% de poliacrilamida en presencia de SDS (SDS-PAGE).

Entre 50-100 µg de proteínas totales en buffer muestra se calentaron a 100 °C por 10 minutos y luego se sembraron en el SDS-PAGE, en paralelo con un marcador de peso molecular (Dual Color Standards, BioRad), utilizando un equipo Mini-Protean III de BioRad para la corrida electroforética, siguiendo las instrucciones del fabricante. La corrida se llevó a cabo en buffer de corrida, a 120 V utilizando la fuente de poder PowerPac Basic Power Suplly (BioRad).

7.2.4. Transferencia.

Luego de la corrida electroforética, se retiró el gel y las proteínas fueron transferidas a una membrana de polifluoruro de vinilideno (PVDF, Immuno-Blot PVDF membrane, BioRad) utilizando el método húmedo Mini Trans-Blot Cell de BioRad. La transferencia se realizó en buffer de transferencia por 1 hora a 100 V en la misma fuente de poder. Previo a la transferencia, los papeles de filtro, las esponjas y las membranas fueron equilibradas por 10 minutos en buffer de transferencia.

7.2.5. Incubación con anticuerpos.

Luego de la transferencia, las membranas se bloquearon por 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave o toda la noche a 4 °C con leche descremada al 5 % p/v en PBST. A continuación, se agregó el anticuerpo primario correspondiente durante dos horas a temperatura ambiente con agitación suave o toda la noche a 4 °C, a las concentraciones detalladas anteriormente. Luego, se retiró el anticuerpo y la membrana se lavó 6 veces por 5 minutos con PBST y agitación, a temperatura ambiente. Posteriormente, se procedió a agregar el anticuerpo secundario a la concentración detallada anteriormente durante 2 horas, con agitación leve a temperatura ambiente. Finalmente, se retiró el anticuerpo secundario y se lavó la membrana 6 veces por 5 minutos con PSBT y agitación a temperatura ambiente y se procedió al revelado.

7.2.6. Revelado.

Para el revelado por quimioluminiscencia se prepararon dos soluciones: Solución 1:

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- 50 µl de luminol (Sigma) 0,044 gr/ml en DMSO

- 22 µl de ácido p-cumárico (Sigma) 0,015 gr/ml en DMSO - 335 µl de buffer Tris 1,5M pH 8,5 Llevar a 5ml con H2O Solución 2: - 335 µl de buffer Tris 1,5M pH 8,5 - 3,2-8 µl de H2O2 40 vol. Llevar a 5ml con H2O

Luego del último lavado con PBST, éste se retiró y se secó la membrana. En la oscuridad, se mezclaron las soluciones 1 y 2 e inmediatamente se volcaron sobre la membrana. Luego de 1 minuto se sacó la membrana de la solución de revelado y se colocó en un casete de exposición Kodak y por encima una placa radiográfica (Hyperfilm ECL, Amersham Biosciences), por 1-10 minutos. Luego la placa se sumergió en solución reveladora hasta la aparición de bandas, se enjuagó rápidamente con agua corriente, se colocó en solución fijadora por unos minutos, se enjuagó con agua corriente y se dejó secar. Teniendo en cuenta el marcador de peso molecular de la membrana, se procedió a analizar las bandas obtenidas.

7.3. Identificación de proteínas por inmunohistoquímica (IHQ).

Esta técnica se utilizó tanto para determinar la presencia y distribución de GPAT2 en cortes de testículos de ratón a distintas edades y en testículos de ratones inyectados con partículas lentivirales, como también para la determinación de GPAT2 en microarreglos de cortes de tejidos (tissue microarray, TMA) mamarios humanos cancerosos (N= 36) y normales (N= 6) (Origene, CT565863).

7.3.1. Obtención de tacos de parafina y cortes histológicos de testículo de ratón.

Los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical por el personal autorizado del Bioterio de la FCM y los testículos fueron extirpados e inmediatamente sumergidos en solución de fijación de Bouin por un mínimo de 30 minutos. Luego, los testículos fueron deshidratados por pasajes sucesivos por etanol en graduaciones crecientes, luego por xileno e incluidos en tacos de parafina que fueron cortados en láminas de 4 µm de espesor para luego ser montados sobre portaobjetos previamente silanizados. Esto fue realizado en la Cátedra de Patología de FCM.

7.3.2. Inmunohistoquímica.

Una vez obtenidos los cortes de testículo, éstos fueron re-hidratados en xilol y luego en soluciones de etanol de concentraciones decrecientes (100 %, 95%, 70% y 50%). Después, se bloqueó la peroxidasa endógena colocando los portaobjetos por 15 minutos en peróxido de hidrógeno (40 vol.): metanol 1/100. Luego, se lavaron 3 veces con PBS, se escurrieron bien y,

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para el bloqueo, se colocaron en cámara húmeda con suero equino al 20% en PBS/BSA 1%, por 15 minutos. A continuación, se lavaron 3 veces con PBS y se colocaron en buffer citrato calentado a hervor por 15 minutos para la recuperación antigénica. Se lavaron con PBS, se agregó el anticuerpo primario anti-GPAT2, en la dilución mencionada, en PBS/BSA 1% y se incubaron en cámara húmeda por toda la noche a 4 °C. Pasada la incubación, se realizaron 3 lavados con PBS, se agregó el anticuerpo secundario anti-conejo conjugado a peroxidasa, a la dilución especificada, en PBS/BSA 1 % y se incubaron por 1 hora a temperatura ambiente en cámara húmeda. Luego de lavar 3 veces con PBS se revelaron con diaminobencidina (DAB). Para ello, se disolvieron 5 mg de DAB en 5 ml de PBS, se filtró y se agregaron 10 µl de H2O2 40 vol.

Esta solución se volcó sobre los cortes y se incubó por 15 minutos a temperatura ambiente, en ausencia de luz. El compuesto DAB es una sustancia que, junto con el peróxido de hidrógeno, forma un sustrato para la peroxidasa, que da lugar a un producto marrón, que precipita. Luego, se lavaron 3 veces con PBS y se contratiñeron con hematoxilina (Biopack), por 5-15 minutos. Se enjuagaron con agua corriente primero y agua destilada después y se deshidrataron pasando por el tren de alcoholes en concentraciones crecientes de etanol y finalmente por xilol. Para el montaje se clocó una gota de bálsamo de Canadá (Biopack) sobre cubreobjetos limpios y se colocaron sobre los portaojetos, cuidando que no queden burbujas. Se dejaron secar en estufa a 45 °C por dos días y se procedió a su análisis en microscopio Olympus BX45.

En paralelo, se realizaron tinciones con hematoxilina-eosina. Para ello, luego de la rehidratación de los cortes, se sumergieron en coplins con hematoxilina por 10-15 minutos, luego se lavaron con agua corriente y se tiñeron con eosina (Biopack) por 5-10 minutos. Luego de enjuagar con etanol al 50 %, se deshidrataron y se montaron con bálsamo de Canadá.