Pruebas de condiciones para aislamiento en medio sólido

Con el fin de obtener cultivos puros de microalgas, se ensayaron diferentes condiciones de cultivo en VECP sólido, variando las concentraciones del fertilizante en cada una. En las 3 condiciones estudiadas (1) 0,47% v/v, 2) 0,93 % v/v y 3) 1,4 % v/v), se observó el crecimiento de microalgas, hongo filamentosos y levaduras. De todos modos, se constató que a mayores concentraciones de fertilizante, el crecimiento de las microalgas se ve levemente favorecido frente a otros microorganismos presentes en las muestras. La selección de las concentraciones de fertilizante utilizadas se basó en estudios realizados anteriormente por un equipo investigador del laboratorio de ORT.

El crecimiento de las microalgas en placa tuvo lugar en una estantería metálica con 6 tubos de luz acoplados de 21 W, sobre una plancha de telgopor (utilizado como aislante para disminuir calor transferido de los tubos de luz ubicados debajo del estante) y en un cuarto con temperatura controlada.

La posición de las placas en la estantería fue evaluada en dos condiciones diferentes: tapa hacia arriba y tapa hacia abajo, con el objetivo de determinar la mejor condición de crecimiento en las instalaciones utilizadas. Se observó, en aquellas placas creciendo con la condición tapa hacia arriba, una gran condensación a las 48 h de crecimiento. Las posibles causas de esta problemática se adjudicaron a la función deshumificadora del aire acondicionado de la sala, que se encontraba encendido durante 24 h, y a la exposición de la estantería al calor de la iluminación artificial. Si bien desde un principio se tuvo presente que podia llegar a aparecer condensación, se realizaron estas pruebas ya que la leve opacidad del medio de cultivo podía ocasionar una disminución de la luz que las microalgas recibieran (fotorresistencia) y afectar su crecimiento. La condensación de agua en la tapa de las placas impidió el correcto crecimiento del cultivo y además, favoreció la contaminación de los mismos ya que la actividad de agua aumenta en el microambiente de la placa. A raíz de lo mencionado anteriormente, se determinó que la mejor orientación de las placas es tapa hacia abajo para evitar la condensación de las mismas.

Una vez que se determinaron las mejores condiciones de cultivo en placa, se procedió con el aislamiento mediante estriado en placas en medio VECP 1,4% v/v, en fotoperíodo 24 h y temperatura 24-26 °C (adaptada a la infraestructura del laboratorio). Al cabo de los 4-5 días de realizado el estriado, se observó el crecimiento macroscópicamente de microalgas así como también, la contaminación con hongos filamentosos. Además, se constató la contaminación con bacterias Gram negativas y levaduras mediante la visualización al microscopio óptico, y por técnicas de tinción, como Gram (Figura 27) y azul de metileno.

74 Figura 27. Observación de frotis con tinción Gram

por microscopía óptica a 40X de una placa contaminada.

Debido a la alta contaminación y a la dificultad que presentó el aislamiento de las microalgas en las muestras previamente enriquecidas, se realizaron sucesivos reaislamientos de colonias de microalgas en medio VECP sólido utilizando antibióticos y ajustando el pH del medio. Los antibióticos fueron aplicados para disminuir la carga bacteriana, incluyendo las bacterias que realizan fotosíntesis (cianobacterias). Numerosos géneros de cianobacterias pueden llevar a la formación de floraciones tóxicas por la producción de cianotoxinas. Las cianotoxinas, son sintetizadas como metabolitos secundarios dentro de la microalga y producen efectos diversos según la especie dominante de la floración, su nivel de toxicidad, el tipo de toxina y las características del organismo afectado (130). El género Microcystis spp. es generalmente el que desarrolla la mayoría de las floraciones tóxicas frecuentes en Uruguay, produciendo la toxina microcistina. Dicha toxicidad puede ser grave tanto para animales como para humanos, siendo hepatotóxicas y/o neurotóxicas y en algunos casos bioacumulables, es decir que la ingestión continuada de la sustancia aumenta su concentración progresivamente en el organismo (125).

Por esta razón, las cianobacterias no son de interés en el presente trabajo, ya que una de las aplicaciones de las microalgas, estará asociada a un centro educativo con niños.

Está reportado que la penicilina en concentraciones de 0,2 a 5 mg/mL no afecta al crecimiento de las microalgas eucariotas (109). Se optó por el uso de ampicilina a las concentraciones reportadas, la cual tiene el mismo mecanismo de acción que la penicilina, ya que pertenece a la familia de los β-lactámicos. Esta familia de antibióticos forma complejos covalentes con proteínas de unión a la penicilina (PBPs Penicillin Binding Proteins) en bacterias, interfiriendo con la habilidad de síntesis de pared celular constituida por peptidoglicano (131). En resumen, la ampicilina actúa, tanto contra bacterias Gram positivas como Gram negativas (131,34). Por otra parte, se observó que un aumento en el pH del medio a 8, favoreció al crecimiento de microalgas y a la vez disminuyó el crecimiento de contaminación con hongos filamentosos. Esto se debe a que, generalmente el crecimiento de hongos filamentosos se ve favorecido en medios ácidos (132).

La combinación del aumento del pH del medio y la adición de ampicilina 0,5 mg/mL disminuyó la carga de contaminantes. Sin embargo, al persistir la contaminación bacteriana se decidió duplicar la concentración de ampicilina en el medio a 1 mg/mL. Dado que dicho aumento no

75 resultó en una disminución significativa de la carga bacteriana, se procedió al reaislamientos en medio con ampicilina 1 g/L y gentamicina 0,2 g/L. Esta combinación de antibióticos permitió una disminución del crecimiento bacteriano frente al uso de ampicilina únicamente.

De acuerdo a la bibliografía consultada, el uso de un β-lactámico junto con gentamicina (aminoglicósido, interfiere en la sintesis de proteínas) en la dosis utilizada, constituye una mezcla de acción efectiva y generalmente tolerada por la mayoría de las microalgas eucariotas (34). Esto se verificó microscópicamente y macroscópicamente, y se constató que el crecimiento de las microalgas no se vio afectado por el uso de antibióticos en el medio.

Además del uso de antibióticos para disminuir la contaminación, se aumentó la rigurosidad de trabajo para mantener la esterilidad durante el manejo de las muestras, tanto en los materiales como en las instalaciones utilizadas. Se eliminó el uso de ansas plásticas en el flujo laminar y se utilizaron en su lugar mecheros y ansas metálicas para los reaislamientos, observándose una disminución en la presencia de contaminaciones.

Por otra parte, estudiantes de la Universidad ORT Uruguay en el curso de Microbiología 2014 de la Licenciatura en Biotecnología, realizaron pruebas comparando el crecimiento de microalgas en medio VECP y en medio BG11, líquido y sólido. El medio VECP es un medio de formulación propia y por lo tanto no hay reportes anteriores del mismo. A través de dichas pruebas, se constató que el medio BG11 tanto en medio sólido como en medio líquido favorece el crecimiento de microalgas frente a otros microorganismos, respecto al medio VECP. Esto se debe a que el medio BG11 es un medio definido y específico para algas, a diferencia del medio VECP conteniendo fertilizante para plantas.