Pruebas de confirmación

Existen varias técnicas para poder confirmar los resultados obtenidos en el screening: Western blot (WB), Inmunofluorescencia (IFI), Radioinmunoprecipitación (RIPA), LIA y modificaciones (RIBA, Matrix, Pepti lav etc.)

La prueba de confirmación más utilizada actualmente es la técnica de Western blot, debido a su especificidad. Este test emplea antígenos virales obtenidos por cultivo celular; después, mediante electroforesis se separan las distintas proteínas víricas según sus pesos moleculares y se transfieren a un papel de nitrocelulosa, poniéndose éste en contacto con el suero problema. Los anticuerpos se detectan añadiendo una anti-IgG humana marcada con una enzima (peroxidasa) que produce unas bandas coloreadas al añadir un substrato. De esta forma se detectan anticuerpos específicos frente a las distintas proteínas del VIH-1. El mayor problema que presenta la técnica de WB es la interpretación de resultados. Desde el punto de vista diagnóstico hay que considerar la presencia de reactividad frente a las siguientes proteínas:

gp 160 precursora de la envoltura env

gp 120 glucoproteína externa env

gp 41 glucoproteína transmembrana env

p 55 precursora del core gag

p 40 precursora del core gag

p 24 proteína principal gag

p 17 proteína de la matriz gag

p66 transcriptasa inversa pol

p 51 transcriptasa inversa pol

p 32 endonucleasa pol

T

Taabbllaa11--1100.. CCrriitteerriioossddeeppoossiittiivviiddaaddppaarraaeellVVIIHHppoorrllaattééccnniiccaaddeeWWBB

CRITERIO REACTIVIDAD FRENTE AL

MENOS

Organización Mundial de la Salud (OMS) Dos glucoproteínas cualquiera de: gp160/gp120/gp41

Food and Drug Administration (FDA) p24 + p32 + (gp41 o gp120 o gp160)

Cruz Roja Americana Una proteína de cada gen

estructural (env, gag y pol) Consortium for Retrovirus Serology and

Standardization (CRSS)

p24 + (gp41 o gp120 o gp160) ó p32 +(gp41 o gp120 o gp160) Association of State and Territorial Public

Heath Laboratory Directors/Center for Disease Control

p24 + (gp41 o gp120 o gp160) ó gp41 + (gp120 o gp160)

Hay consenso en todos los criterios en definir un WB negativo como aquel que no presenta ninguna banda y WB indeterminado a aquel que presenta bandas que no corresponden a las del mínimo de positividad utilizado, y puede darse en distintas situaciones:

§ Reactividad cruzada con otros retrovirus como el VIH-2.

§ En los períodos precoces de la infección VIH, semanas o meses antes de la seroconversión total.

§ Enfermedad avanzada, por presencia de inmunocomplejos y deterioro inmunológico grave, se puede ver reducido el título de anticuerpos circulantes.

§ En niños nacidos de madres seropositivas, tanto de los infectados como de los portadores pasivos de anticuerpos maternos durante los primeros meses de vida.

§ En individuos africanos, debido a la mayor variabilidad genética del virus en ese continente y a la hipergammaglobulinemia producida por la parasitosis.

Ante un resultado de WB indeterminado hay que realizar un seguimiento al menos durante seis meses. Si para entonces el WB sigue indeterminado y el paciente no tiene factores de riesgo y está asintomático, puede considerarse negativo.

Aunque el WB sigue siendo el método más utilizado para la confirmación de positividad obtenida en las pruebas de screening, presenta limitaciones como su elevado coste, largo tiempo de realización, necesidad de personal adiestrado, condiciones de la muestra y del análisis, diferente valor predictivo de cada banda y diversidad de criterios de interpretación de resultados. Para tratar de paliar esto, ha aparecido en el mercado un sistema informático de semicuantificación de las bandas de WB para limitar las interpretaciones subjetivas.

En la técnica de Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) se utilizan linfocitos infectados por el VIH, fijados con acetona, sobre los que se deposita el suero problema. Cuando se añade a esta preparación una IgG humana marcada con fluoresceína se reconoce la reacción antígeno-anticuerpo. La interpretación de este resultado requiere mucha experiencia. Pueden existir falsos positivos por reacciones cruzadas con antígenos HLA.

Los estudios comparativos efectuados indican que esta prueba tiene una sensibilidad y especificidad similar al WB102

, aunque su interpretación puede mostrar una gran subjetividad.

En la técnica de Radioinmunoprecipitación (RIPA) se emplean antígenos víricos previamente marcados con un isótopo radioactivo posteriormente se les hace reaccionar con el suero problema. Los complejos antígeno-anticuerpo formados se separan por electroforesis en gel de poliacrilamida, se pone en contacto con rayos X y se revela, apareciendo diversas bandas que corresponden a las diferentes proteínas víricas unidas a los anticuerpos del paciente.

Los patrones son similares a los del WB pero el RIPA es más sensible para detectar los anticuerpos anti-gp120/160 por lo que su empleo está indicado para confirmar seroconversiones más precozmente que el WB. Su utilización se recomienda en situaciones de repetidos WB indeterminados, en personas con factores de riesgo para el VIH. Sin embargo es una técnica compleja limitada a

inmunoenzimáticos de tipo lineal (LIA), incorporan proteínas recombinantes o péptidos sintéticos del VIH-1 y VIH-2 en un soporte plano. Su sensibilidad y especificidad son buenas y en algunos casos son técnicas automáticas lo que resta subjetividad a la hora de interpretar resultados103.

En países donde no se puedan utilizar pruebas confirmatorias clásicas (WB, IFI, RIPA, etc.…) por su elevado coste o por su compleja realización se puede seguir la siguiente estrategia: Se analizan las muestras con una primera prueba de screening y las positivas se someten a un segundo test, también de screening, siempre que las dos técnicas sean de distinto diseño, es decir, si la primera prueba es EIA indirecto la segunda deberá ser EIA competitivo o viceversa.