PTA-7 Cuantificación de ADN nuclear 1 Descripción del procedimiento:

Mediante la cuantificación se pretende determinar la cantidad total de ADN humano extraído de cada muestra con objeto de ajustar la concentración de los extractos para su posterior amplificación mediante PCR. También sirve para verificar la presencia de inhibidores en la muestra.

Se trata de un ensayo que combina la actividad 5´ nucleasa de la Taq polimerasa que tiene lugar durante la PCR con la emisión de fluorescencia por parte de una sonda que hibrida específicamente con una región específica del genoma nuclear humano que varía según el Kit utilizado.

El ensayo consiste en un par de primers específicos para ADN humano y una sonda TaqMan® MGB marcada con FAM para detectar la secuencia amplificada. Se emplea una sonda que hibrida específicamente con una región específica del gen hTERT- transcriptasa inversa de la telomerasa humana, de 62 pb.

Durante el ensayo existe un fluoróforo (ROX®) que no interviene en la reacción de amplificación, y que está a una concentración fija, que sirve para normalizar la emisión de fluorescencia.

Como control de calidad de la reacción de amplificación está el IPC (secuencia sintética de ADN no encontrada en la naturaleza) consiste en un templado de ADN, dos primers para amplificar esta secuencia y una sonda marcada con VIC para su detección. Este IPC permite distinguir entre verdaderos “negativos” y reacciones afectadas por la presencia de inhibidores o fallos propios del ensayo.

Durante la fase exponencial de la reacción de amplificación, la fluorescencia es detectada por el software SDS en un punto de comparación (threshold o umbral), determinado y validado por la casa comercial, en el que se cumple:

X = X0.(1+E)n

donde X es la concentración del producto amplificado en un ciclo determinado, X0 la concentración inicial de la muestra, E la eficiencia de la reacción y n el número del ciclo.

Se define CT como el número de ciclos que se necesita para llegar al threshold o umbral, dependiendo su valor de la concentración inicial y de la eficiencia.

77 Sustituyendo n por CT en la ecuación anterior, aplicando logaritmos, y resolviendo la ecuación:

CT = -[1/log (1+E)].(logX-logX0)

Si la eficiencia es del 100%, obtenemos un valor para -[1/log (1+E)] de -3,32, que es el valor teórico de la pendiente, estableciéndose un rango de tolerancia dependiendo del kit usado.

La emisión de fluorescencia es detectada por el software, que analiza, procesa y normaliza el dato bruto obtenido durante la reacción.

3.4.7.2. Fases del procedimiento analítico

A) Preparación de los estándares de cuantificación

La preparación de los standards de tamaño del 1 al 8 (de 50 ng/ml a 0.023 ng/ml) se realiza utilizando TE para la realización de las diluciones. Los pasos a seguir se detallan a continuación y se podrán realizar de modo manual o mediante plataforma robótica:

1. Preparar 8 tubos Eppendorf rotulados: Std1, Std2, Std3, Std4, Std5, Std6, Std7 y Std8 con la fecha del día de preparación.

2. Dispensar en el primer tubo 30 ml de TE y 20 ml en lo siete restantes.

3. Agitar y dar un "spin" al tubo del standard de 200 ng/ml contenido en el kit y dispensar en el primer tubo (Std 1) 10 ml. (Dilución 1/4)

4. Agitar y dar un "spin" al tubo std 1, en caso de elaboración manual, o resuspender en caso de realización mediante plataforma robótica.

5. Transferir 10 ml del std 1 al tubo std 2 (dilución 1/3)

6. Repetir el paso 4 y 5 en los tubos sucesivos hasta llegar al std 8.

7. Mantener los estándares una vez preparados refrigerados en nevera entre 2-8ºC.

B) Preparación de la mezcla de amplificación

La preparación de la mezcla de amplificación se realiza en cabina de seguridad biológica situada en el cuarto o zona de preparación de la PCR.

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El valor a añadir resulta de multiplicar la cantidad de cada reactivo por la suma de las muestras a cuantificar, más diecisiete (16 destinados a 8 estándares de cuantificación por duplicado y 1 para el tampón de elución) y el margen de exceso que se determine por pérdidas en el pipeteo.

La cantidad total de Primer Mix y Reaction Mix se mezclan en tubos Eppendorf de 1.5 ml, y una vez homogeneizados se dispensa en la placa de 96 pocillos de tipo "óptico”.

C) Dispensación de mezcla de amplificación, muestras, estándares y tampón de elución

Se dispensará por pocillo:

• 23 μl de la mezcla de Primer Mix y Reaction Mix en cada pocillo.

• 2 μl de muestra / 2μl de cada standard por duplicado / 2 μl de TE (control negativo).

D) Preparación de la placa para la reacción

Una vez finalizada la dispensación de reactivos, muestras, estándares y control negativo, se cubre la placa con la cubierta adhesiva, y se le da un "spin" o centrifugación instantánea en la centrífuga para placas, comprobando que las burbujas de aire han desaparecido y que no quedan gotas por las paredes.

E) Preparación de la PCR cuantitativa

Se realiza en el equipo 7500 Real Time PCR System de Life Technologies - Applied Biosystems, utilizando el software asociado al instrumento y siguiendo las condiciones y el protocolo del fabricante (figura 6).

3.4.7.3. Interpretación de los resultados

La cuantificación se considerará correcta siempre que los valores de pendiente obtenidos estén comprendidos entre los valores -2.9 a -3.3.

3.4.7.4. Referencias o Manuales del fabricante Life Technologies®

• Quantifiler kits User’s Manual – Quantifiler Human DNA Quantification kit and Quantifiler Y Human male DNA Quantification kit.

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Figura 6: ciclo de amplificación

3.4.7.3. Interpretación de los resultados

La cuantificación se considerará correcta siempre que los valores de pendiente obtenidos estén comprendidos entre los valores -2.9 a -3.3.

3.4.7.4. Referencias o Manuales del fabricante Life Technologies®

• Quantifiler kits User’s Manual – Quantifiler Human DNA Quantification kit and Quantifiler Y Human male DNA Quantification kit.

• HID Real Time PCR Analysis Software v1.2