11 6.MODIFICACIONES DE LAS CASEINAS POR EFECTO DEL CALENTAMIENTO DE LA LECHE
111.2,2 TÉCNICAS ELECTROFORÉTICAS
III. 2 3 9 Purificación parcial de los anticuerpos
La precipitación con sulfato amónico es uno de los métodos más utilizados para la separación de las proteínas de una solución acuosa. Cuando se añaden concentraciones elevadas de iones amonio y sulfato, éstos compiten con las proteínas en su unión por el agua. De esta forma, las proteínas al perder su unión con las moléculas de agua, disminuyen su solubilidad lo que
origina su precipitación. La concentración de sulfato amónico más conveniente para precipitar anticuerpos es del 50 %. Uno de los inconvenientes de
precipitar los anticuerpos con sulfato amónico es que los anticuerpos así purificados están contaminados por otras proteínas de alto peso molecular que
quedan retenidas en los flóculos del precipitado.
La purificación parcial de los anticuerpos monoclonales se realizó de acuerdo a la técnica descrita por Harlow y Lane (1988). Para ello, 1 ml de líquido ascítico se centrifugó a 3000 g durante 30 minutos. Una vez centrifugado se recogió el sobrenadante, al que se añadió en agitación, un volumen igual de una solución saturada de sulfato de amonio 4,1 M pH 7,4. Seguidamente, la solución se mantuvo en reposo a 40C durante 12 h y se volvió a centrifugar a 3000 g durante 30 mm para recuperar las imnunoglobulinas precipitadas. Eliminado el sobrenadante, las inmunoglobulinas presentes en el sedimento se resuspendieron en 2 ml de un tampón fosfato salino (PBS, de pH 7,2), y a continuación, se dializaron frente a PBS durante 12 h a 40C. Terminada la diálisis, las inmunoglobulinas se alicuotaron en viales de 2 mí, manteniéndose a -200C hasta su utilización. III. 2. 3.
10.
Determinación de la concentración de inmunoglobulinas delliquido ascitico purificado
Finalmente, para determinar la concentración del anticuerpo en el líquido
ascítico purificado, se procedió a medir la absorbancia del mismo a 280 mii utilizando el factor de conversión descrito por Layne (1957), Harlow y Lane (1988) y Peterson (1983), que establece para las Ig U, un valor de absorbancia de 1,35, cuando la concentración proteica es de 1 mg/ml.
El método para determinar la concentración proteica de una muestra mediante la cuantificación de la absorbancia a 280 ¡un, presenta las ventajas frente a otros métodos convencionales, como el Lowiy o el Bradford (111.2.3.1), de ser más rápido y de no requerir la destrucción de la muestra. La técnica se basa en medir la absorbancia máxima de una muestra a 280 nm, que se debe esencialmente a la presencia de tirosina y triptófano.
111.2. 3. 11. Conjugación de los anticuerpos purificados con la digoxigenina
La detección y cuantificación de un antígeno o anticuerpo por técnicas inmunoenzimáticas (ELISA), requiere la utilización de anticuerpos que están conjugados a una enzima. Aunque la preparación de estos conjugados generalmente se basa en la interacción covalente entre el enzima y el anticuerpo (Nakane y Kawaoi, 1974>, en los últimos años se han utilizado
otros sistemas de detección enzimáticos más sensibles. La conjugación de los anticuerpos a la biotina y su detección con conjugados de estreptavidina ha sido uno de los sistemas más utilizados (Bonnard y col., 1984). Sin embargo, recientemente se han propuesto otras técnicas que incrementan la sensibilidad, y eliminan la inespecificidad de la señal, que en ciertos casos, se asociaba al sistema biotina-avidina. En este trabajo, los anticuerpos se conjugaron a la digoxigenina siguiendo el protocolos descrito por Zischler y col., (1989). Los anticuerpos conjugados a la digoxigenina se detectaron con los fragmentos de la región variable de anticuerpos comerciales (Fai), obtenidos en oveja frente a la digoxigenina y conjugados a una enzima.
La digoxigenina es una molécula de bajo peso molecular. Debido a su pequeño tamaño molecular, su unión con el anticuerpo es más estable que cuando éste se conjuga directamente con una enzima. Además, el pequeño tamaño de la digoxigenina permite que cada imnunoglobulina se una a varias moléculas de digoxigenina, y por consiguiente, facilita que a cada inniunoglobulina conjugada se unan varios anticuerpos anti-digoxigenina. De esta fonna, la estequiometría de la reacción entre los dos anticuerpos permite detectar el antígeno con una sensibilidad mayor. La unión de la digoxigenina con el anticuerpo es fácil de realizar, y presenta la ventaja de que el anticuerpo no pierde la especificidad por el antígeno.
En la conjugación de los anticuerpos se empleó un éster de la digoxigenuna denominado N-liidroxisuccinimida digoxigenina-3-O-succinil-c- aminocaproato, que se resuspendió en dimetilsulfóxido a una concentración de 2 mg/ml. Seguidamente, los anticuerpos purificados se disolvieron en un tampón PBS de pH 7,2, a una concentración de 1 mg/mi, y la solución de digoxigenina se añadió a la del anticuerpo, en una relación molar digoxigeninalanticuerpo de 10:1. La mezcla resultante se incubó durante 2 h a temperatura ambiente con agitación suave. Para eliminar la digoxigenina libre se empleó una técnica de cromatografía de filtración en gel, utilizando una columna de Sephadex G-25. En primer lugar, se equilibró el relleno de la columna con 30 ml del tampón PBS y a continuación, se dejó pasar la mezcla digoxigenina-anticuerpo. La elución del anticuerpo conjugado y de la digoxigenina libre se hizo con el tampón PBS, recogiendo fracciones de 0,5 ml. Posterionnente, se midió la absorbancia de las fracciones eluidas a 280 mn. La lectura de los valores obtenidos demostró la existencia de dos picos, que se correspondían con el anticuerpo conjugado y la digoxigenina libre. Los anticuerpos purificados y conjugados se alicuotaron conservándose a -200C, hasta el momento de su utilización.
111.2.4. OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS POLICLONALES
A diferencia de los anticuerpos monoclonales, los anticuerpos policlonales son una mezcla heterogénea de anticuerpos procedentes de muchos clones de linfocitos B, y por ello, reaccionan frente a distintos detenninantes antigénicos. Estos anticuerpos, se encuentran en el suero de animales de laboratorio que están sometidos a la exposición continuada de un antígeno, y por ello, su disponibilidad es limitada.
El hecho de que la afmidad y la especificidad de estos anticuerpos sean variables según los lotes de animales empleados en la inmunización, obliga a purificar los inniunosueros, mediante técnicas de purificación largas y costosas. Sin embargo, el bajo coste de su obtención hace en ciertos casos conveniente su obtención.
III. 2. 4. 1. Pauta de inmunización
Para la producción de imnunosueros, se empleó un lote de 3 conejos machos de raza neozeolandesa, de 2,5 Kg de peso. El Lote se inoculó con la fracción j3-caseina de la leche de vaca, purificada por FPLC según se describió en el apanado 111.2.1.2.
La inmunización comenzó con la inoculación intradérmica, repartida en varios lugares del dorso, del antígeno (5 mg) emulsionado en una mezcla a partes iguales (0,5 mí) de Adyuvante Completo de Freund y de suero fisiológico estéril (NaCí al 0,85 % p/v). Las dosis siguientes se inocularon vía intramuscular, durante un periodo de 4 meses a intervalos de 7 días (Tabla 111.2.), sustituyendo, a partir de la segunda inyección, el Adyuvante Completo de Freund por el Incompleto.
Antes de la primera inoculación del antígeno y para comprobar la ausencia de reactividad de los animales frente a dicho antígeno utilizado, se realizó una sangría inicial (se). Asimismo, a los 45, 66, 88 y 108 días de la primera inoculación, se realizaron sangrías parciales de la arteria central de la oreja, con e] fin de verificar la eficacia del proceso de inmunización.
Para comprobar la producción de anticuerpos frente a las caseínas de vaca, se utilizó la técnica del ELiSA indirecto, empleando los inmunosueros procedentes de las sangrías parciales realizadas a los conejos. Los valores de absorbancia obtenidos con las muestras de inniunosuero, demostraron que el titulo de los sueros era suficiente para proceder a la sangría final de los conejos.
lóbla 111.2. Pauta de inmunización de los conejos por caseína de la leche de vaca
inoculación de la (3- Días (3-caseína (mg) Inoculación (mi) SFE (mi) ACF (mi) AIF (mi) Sangría 0 5 ID 0,5 0,5 — 10 5 IM 0,5 — 0,5 31 5 IM 0,5 0,5 38 5 IM 0,5 — 0,5 45 5 IM 0,5 0,5 54 5 ID 0,5 — 0,5 59 5 IM 0,5 — 0,5 66 5 IM 0,5 — 0,5 73 5 IM 0,5 — 0,5 77 5 IM 0,5 0,5 88 5 IM 0,5 — 0,5 53 94 5 IM 0,5 — 0,5 101 5 IM 0,5 — 0,5 108 5 IM 0,5 — 0,5 111 — — — — SE ID: Intradénnica IM: Intramuscular
SFE: Suero fisiológico estéril
ACF: Adyuvante Completo de Freund S~: AIF: Adyuvante Incompleto de Freund 52:
5,: Sangría inicial Sangría día 45 Sangría día 66 Sangría día 88 Sangría día 108 Sangría final III. 2. 4. 2. Sangría final
A los 111 días del comienzo del proceso de inmunización y una vez comprobado que el título de los inmunosueros era el adecuado, se efectuó la
sangría final de los animales. Para ello, se anestesiaron los animales via intravenosa en la vena marginal de la oreja con pentobarbital (35 mg/Kg de peso). A continuación, se colocaron sobre una mesa en posición de decúbito supino, imnovilizándoles las cuatro extremidades y seguidamente, se les introdujo una aguja (18G) ente el cuarto y el quinto espacio intercostal de la región torácica. Cuando la aguja ya estaba en posición intracardiaca, se fue recogiendo el plasma sanguíneo en tubos de vidrio hasta el desangrado
III. 2. 4. 3. Obtención y conservación del suero
La sangre obtenida se mantuvo durante 3 h a temperatura ambiente, para facilitar la formación del coágulo. A continuación, se separó cuidadosamente el coágulo de las paredes de los tubos con ayuda de una espátula y se mantuvo a 40C durante 18 h para favorecer su retracción. El suero se transvasó a tubos de centrífuga y se centrifugó durante 20 mm a 700 g a una temperatura de 40C. El sobrenadante obtenido, se filtró a través de un filtro de 0,45 ~m de tamaño de poro, y se alicuotó previa adición de rAda de sodio (0,01 % p/v). Las fracciones alicuotadas en viales se conservaron en congelación a -200C, hasta el momento de su utilización.
III. 2. 4. 4. Purificación parcial de los inmunosueros
Se procedió a purificar los ininunosueros obtenidos frente a la [3-caseína de la leche de vaca mediante precipitación selectiva con sulfato amónico al 50 %, de acuerdo al protocolo descrito en el apartado 111.2.3.8.
111.2.5. TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS III. 2. 5. 1. Técnica del ELISA indirecto
En esta técnica, los antígenos de la muestra se fijan por adsorción pasiva a una superficie inerte (placas de poliestireno de 96 pocillos). Seguidamente, se añaden los anticuerpos específicos que al reconocer al antígeno quedan unidos a él. Después de un lavado que elimina las moléculas que no han reaccionado, aquellos anticuerpos que han quedado unidos al antígeno fijado a la placa se detectan por un segundo anticuerpo marcado con una enzima. Se lava de nuevo la placa, y se añade a continuación el sustrato de la enzima, y ambos al reaccionar producen un compuesto coloreado. La intensidad de color que se produce en la reacción es proporcional a la concentración del antígeno de la muestra.
Antígenos:
Como antígenos se emplearon leches y quesos cuya procedencia se indica en el apartado 111.1.3.1.
Se prepararon dos tipos de mezclas de leche cruda, una de vaca/oveja y otra de vaca/cabra, añadiendo a las leches de oveja o cabra cantidades crecientes de leches de vaca (0,5; 1, 2,5; 5, 10, 15, 25, 50, 75 y 100 %).
Asñnismo, se preparó una mezcla vaca/oveja con leche de oveja a la que se añadían cantidades crecientes (0,5; 1, 2,5; 5, 10, 15, 25, 50, 75, y 100 %) de
leches de vaca comerciales tratadas térmicamente (pasteurizada, esterilizada y UHT).
La identificación del origen animal de una leche en quesos hubiera requerido una elaboración controlada de los quesos a partir de las mezclas lácteas que se hubieran preparado previamente. Sin embargo, y dado que carecíamos de la infraestructura necesaria para su realización, se procedió a preparar las muestras utilizando quesos adquiridos en centros comerciales. Como estándares se emplearon quesos genuinos elaborados a partir de leche de vaca, oveja o cabra y, las mezclas se prepararon incorporando en quesos genuinos de oveja o cabra, cantidades crecientes de quesos de vaca (0,5; 1, 2,5; 5, 10, 15, 25, 50, y 100 %). Los extractos de queso (25 g) se
homogeneizaron en 500 ml de tampón PBS, pH 7,2. Para eliminar la grasa, los homogeneizados se filtraron por lana de vidrio, y posteriormente, se alicuotaron en fracciones de 1 mí, manteniéndose a -200C hasta su utilización.
Anticuerpos:
Se utilizaron los anticuerpos monoclonales anti-13-caseína de la leche de vaca obtenidos en ratones y purificados parcialmente mediante precipitación selectiva con sulfato amónico al 50 %.
Conjugado:
Se empleó un conjugado comercial de anti-inimunoglobulinas de ratón obtenidas en conejo y marcadas con peroxidasa de rábano.
Tampones y reactivos: 1.- Tampón PBS Se compone de: NaCí 0,14 M Na2HPO4. 12H20 8,1 mM KH2PO4 1,5 mM KCI 2,7 mM pH 7,2
2.- Tampón PBST
Se prepara como el tampón PBS y se le añade un 1 % de Tween 20, si es para diluir los anticuerpos y un 5 %, si es para lavar las placas.
3.- Sustrato
Se preparó resuspendiendo el ácido 2,2’-azino-bis-3-etilbenzotiazolina sulfónico (ABTS), a una concentración de 1 mg/ml en un tampón comercial (Boebringer) que contenía perborato sódico, ácido cítrico y Na2HPO4.
4.- Solución de tapizado
Se preparó resuspendiendo gelatina al 1 % en el tampón PBS. Metodología del ELISA indirecto:
Los pocillos de una placa de ELISA (Nunc) se sensibilizaron con 100 ~il del antígeno correspondiente, diluido en PBS y la placa se incubó durante 1 h a 370C, tras lo cual se lavó 6 veces con tampón PBST. A continuación, para tapizar las zonas del pocillo en las que no se hubiera adsorbido el antígeno, se añadieron a cada pocillo 200 gí de gelatina al 1 % en tampón PBS. La placa se mantuvo 30 minutos a 370C y los pocillos se Javaron 6 veces con tampón PBST para eliminar el exceso de gelatina. Seguidamente, se añadieron a cada pocillo 100 gí del anticuerpo monoclonal anti-caseína de leche de vaca, diluido en tampón PBST y la placa se incubó en un agitador de placas de ELISA durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalizada la incubación, los pocillos se lavaron de nuevo 6 veces con tampón PBST para eliminar aquellos anticuerpos que no hubiesen reaccionado. A continuación, se depositaron en cada pocillo 100 gí del conjugado diluido en tampón PBST, y de nuevo, la placa se mantuvo en el agitador durante 1 h a temperatura ambiente. Tras lavar los pocillos 6 veces con agua destilada para eliminar los restos de conjugado libre, se añadieron a cada pocillo 100 jil del sustrato, manteniendo la placa en el agitador durante 15 minutos a temperatura ambiente. El color verde resultante de la degradación del sustrato por la enzima, se cuantificó midiendo la absorbancia de cada pocillo a 405 nm en un lector espectrofotométrico de placas de ELISA.
- Control del antígeno: gelatina+ anticuerpo+ conjugado+ sustrato
- Control del anticuerpo: antígeno+gelatina+ conjugado+ sustrato
- Control del conjugado: gelatina+conjugado + sustrato
- Control del sustrato: gelatina +sustrato
Si la absorbancia a 405 mii de alguno de los controles era mayor de 0,150, el experimento se consideraba nulo.
III. 2. 5. 2. Técnica del ELISA indirecto utilizando el sistema de amplificación biotina-avidina
La diferencia entre esta técnica y la técnica del ELISA indirecto descrita en el apartado 111.2.5.1., radica en el empleo de anticuerpos conjugados a la biotina y en su detección por un conjugado comercial de avidina marcada con una enzima (111.2.3.11). El hecho de conjugar los anticuerpos a la biotina para su detección posterior con la avidina, se debe a la gran afinidad (10’~ M’) que tiene la avidina por la biotina. El complejo que se forma por la unión avidina- biotina pennite amplificar la sensibilidad de las reacciones inmunoenzimáticas (ELISA). En una primera fase, el pequeño tamaño molecular de la biotina favorece que por cada ininunoglobulina se unan varias moléculas de biotina. Posteriormente, al contener la avidina varios lugares de unión con la biotina, permite que por cada imnunoglobulina conjugada a la biotina se unan varias moléculas de avidína. Por consiguiente, la estequiometría de la reacción (1: 4), permite detectar la molécula del antígeno con una sensibilidad mayor.
Como antígenos se emplearon las fracciones caseinicas purificadas por FPLC (111.2.1.2) que se caractenzaron parcialmente por SDS-PAGE electroforesis (111.2.2.2).
En esta técnica, se utilizaron anticuerpos policlonales obtenidos en cabra frente a las caseínas de vaca, purificados por cromatografia de afinidad y biotinizados por Rodríguez y col., 1993. Para su desarrollo, se siguieron los mismos pasos y tiempos de incubación que los descritos para el ELISA indirecto (111.2.5. 1), con la única diferencia del uso de un conjugado comercial de avidina marcada con peroxidasa de rábano.
III. 2. 5. 3. Técnica del ELISA competitivo
En esta técnica, el antígeno se fija a una superficie sólida (placas de poliestireno de 96 pocillos) a una concentración conocida. A continuación, se añade el antígeno de la muestra o del patrón junto con el anticuerpo específico, estableciéndose una competición entre el antígeno añadido y el fijado a la fase sólida, en su unión por el anticuerpo. Cuanto mayor sea la concentración del antígeno de la muestra, más inhibida estará la unión del anticuerpo al antígeno fijado a la superficie sólida. Depués de un lavado que elimina todas las moléculas que no hayan reaccionado, aquellos anticuerpos que quedaron unidos al antígeno de la superficie sólida son reconocidos por un segundo anticuerpo marcado con una enzima. A continuación, se añade el sustrato de la enzima y ambos al reaccionar provocan la formación de un compuesto coloreado. La intensidad de color que se produce en la reacción es inversamente proporcional a la concentración del antígeno de la muestra.
Antígenos:
Para tapizar la superficie sólida de las placas se empleó una [3-caseína comercial de leche de vaca. Como muestras se utilizaron las mezclas experimentales de leches crudas y quesos que se han descrito en el apartado 111.2.5.1.
Anticuerpos:
Se utilizaron los mismos anticuerpos que en el ELISA indirecto
Conjugado:
Se empleó el mismo conjugado comercial que en el ELISA indirecto (111.2.5.1).
Tampones y Reactivos:
El tampón PBS, el tampón PBST, el sustrato y la solución de tapizado utilizados se prepararon de igual forma que los descritos en el apanado 111.2.5.1,
Metodología del ELISA competitivo:
Los pocillos de una placa de ELISA (Nunc) se sensibilizaron con 200 ~±l de una [3-caseína comercial de leche de vaca, diluida en PBS y la placa se
incubó durante 1 h a 370C, tras lo cual se lavé 6 veces con tampón PBST. A continuación, para tapizar las zonas del pocillo en las que no se hubiera adsorbido el antígeno, se añadieron a cada pocillo 200
u1
de gelatina al 1 % en tampón PBS. La placa se mantuvo 30 minutos a 370C y los pocillos se lavaron 6 veces con tampón PBST para eliminar el exceso de gelatina. Seguidamente, se añadieron a cada pocillo 50 ~.ilde la muestra antigénica correspondiente junto con 50 jtí del anticuerpo monoclonal anti-caseína de leche de vaca,diluido en tampón PBST y la mezcla se homogeneizó, aspirando y expulsando el volumen líquido repetidas veces con una pipeta multicanal. Posteriormente, la placa se incubó en un agitador de placas de ELISA durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalizada la incubación, los pocillos se lavaron de nuevo 6 veces con tampón PBST para eliminar aquellos anticuerpos que no hubiesen reaccionado. A continuación, se depositaron en cada pocillo 100 ~tl del conjugado diluido en tampón PBST, y de nuevo, la placa se mantuvo en el agitador durante 1 h a temperatura ambiente. Tras lavar los pocillos 6 veces con agua destilada para eliminar los restos de conjugado libre, se añadieron a cada pocillo 100 gí del sustrato, manteniendo la placa en el agitador durante 30 minutos a temperatura ambiente. El color verde resultante de la degradación del sustrato por la enzima, se cuantificó midiendo la absorbancia de cada pocillo a 405 tan en un lector espectrofotométrico de placas de ELISA.
En la prueba se realizaron los siguientes controles:
- Control sin 13-caseína: gelatina+muestra +anticuerpo+conjugado +
sustrato. Si la absorbancia a 405 mu de este control era mayor de
0,150, el experimento se consideraba nulo.
- Control sin muestra antigénica: [3-caseína+gelatina +anticuerpo+
conjugado + sustrato. Este es el valor máximo de absorbancia y
mínimo de inhibición del anticuerpo. III. 2. 5. 4. Técnica del ELISA sandwich
En esta técnica, los anticuerpos específicos se fijan a una fase sólida y actúan como anticuerpos de captuira de los antígenos problema. Los antígenos anclados son reconocidos por un segundo anticuerpo marcado con una enzima. La reacción se pone de manifiesto porque al actuar el enzima sobre el sustrato se libera un compuesto coloreado.
Antígeno:
Como antígenos se emplearon los anticuerpos monoclonales específicos