PURIFICACION DE LA PROTEíNA CODIFICADA POR LA ORF-5 DEL PRRS

El que la proteína sintetizada tuera portadora del “tag” de histidinas, hace posible la purificación de la misma mediante unión a una resma que contiene níquel-acetonitrilo por el que las mismas tiene afinidad como ya se ha reseñado. En este sentido, se decidió intentar la purificación de la proteína E del PRRSV.

En este sentido, realizamos coinfección vTF7-3 y VV-PR5 en células Cos-1. Como control negativo se emplearon células únicamente infectadas con vTF7-3. Los extractos se lavaron en PBS recogiéndose una pequeña fracción (fracción denominada totales). El resto se resuspendió en tampón de lisis (5OmM Tris HCI pH 8; 50 mM CINa; SmM C12 Mg; 10 % glicerol; 0.1

% NP4O; 20 mM imidazol) y tras congelar/descongelar 3 veces, el

precipitado se desechó (fracción de precipitado). El sobrenadante,

(fracción denominada sobrenadante totales) se mezcló con la resma, previamente equilibrada en el tampón de lisis, adsorbiéndose toda la noche en cámara fria en un tubo eppendorff. Tras centrifugar la muestra a 1000

xg durante 2 minutos, el sobrenadante fue eliminado (fracción no

adherida), realizandose varios lavados de la resma con posterioridad. Finalmente, todos las tracciones, incluida la resma final, fueron cargados en un gel de proteínas al 12% y analizados por Western-Blot frente al suero control positivo. Sorprendéntemente la proteína únicamente era detectada en las fracciones de totales, sobrenadante totales y no adherido, no así en los diferentes lavados nken laresina, lo que parecía indicar que por alguna razón no se unía a la misma.

Debido a lo anteriomente expuesto modificamos el tampón de lisis

aumentando al 1 % el porcentaje de NP-40 y eliminando totalmente el

imidazol. Sin embargo, no conseguimos que la proteína se adheriera a la misma.

Resultados

Se especuló entonces que quizás la conformación que presentaba la proteína fuese tal que la cola de histidinas permaneciese escondida, por lo que decidimos desnaturalizar parcialmente la misma con el fin de que esta se expusiese al exterior. Por ello, y siguiendo las recomendaciones dadas por la casa comercial suministradora, decidimos probar que ocurría cuando en el tampón de lisis se añadía hidrocloruro de guanidina. En este sentido repetimos el experimento con una concentración final 4M de hidrocloruro

de guanidina en el tampón de lisis, y la unión en vez de a 4 oC a

temperatura ambiente durante dos horas. Como resultado obtuvimos que la proteína en esta acasión si que se adheria a la resma e intensamente, de modo que una parte quedaba retenida en ella y otra se eliminaba en los primeros lavados con un nuevo tampón de lavado (2OmM fosfato pH 7,8:

500mM NaCí: 8M urea).

Ante los resultados obtenidos, decidimos realizar modificaciones tanto en el tampón de lisis como en el de lavado para fijar las condiciones mas idoneas. Como nuestro objetivo principal era obtener una proteína con la mínima alteración de su conformación, se decidió determinar cual era la

concentración mínima de hidrocloruro de guanidina que debia ser

incorporada al tampón de lisis para que la misma se adheriera a la resma. En este sentido se hicieron pruebas añadiendo a diferentes extractos celulares doblemente infectados <vTF7-3/VV-PR5) tampones de lisis con concentraciones crecientes de hidrocloruro de guanidina, concretamente 0.5M: 1M: 2M: 3M: 4M. así como un extracto que se resuspendió en tampón de lisis sin guanidina. Los lavados se hicieron en el tampón anteriormente señalado pero eliminando la urea e incorporando imidazol a concentración 20 mM. Como resultado final se o¿tuvo que cuando la unión se realiza sin guanidina, la proteina no se adheria y por tanto no aparecía en la resma. Por el contrario, en las muestras que contenian guanidina a concentración 1M la proteína apareclá intensamente adherida a la resma, excepto una

cierta porción que se eliminaba con los lavados. Por ello decidimos

realizar en experimentos posteriores siempre la unión en un tampón con 1 M hidrocloruro de guanidina.

Resultados

Otro punto a considerar, fueron las condiciones de tratamiento de la

columna, en concreto el pH, las concentraciones de urea, y las

concentraciones de imidazol. Así, tras unir la proteína en un tampón de lisis con hidrocloruro de guanidina, la muestra fue dividida en tres partes cada una de las cuales se trató con una de las variables señalada. En el caso del pH, los lavados se realizaron en el tampón de lavado con 500mM NaCí, variando el pH del tampón fosfato 2OmM; tras tres lavados con pH 7,8, se realizaron nuevos lavados con pH 6 y pH 4,3. Con respecto a la urea, los lavados se realizaron con el tampón de lavado base (2OmM fosfato pH 7,8: 500mM NaCí) al que se le añadieron cantidades crecientes de urea.

Así, tras dos lavados sin urea se realizaron lavados por duplicado con concentraciones 2M: 4M: 6M y 8M. Por último los lavados de la muestra tratada con diferentes concentraciones de imidazol se realizaron primero con el tampón de lavado base sin imidazol y posteriormente, con 20 mM: 200 mM: 500 mM: y 700 mM imidazol. Aunque la proteína se detectaba por

Western-Blot en mayor proporción en los lavados realizados a pH 4, 6M

urea y 500 mM imidazol, la mayor parte de la proteína seguía

permaneciendo retenida en la resma.

Ante todo lo expuesto, y como el tener la proteína unida a la resma no era un inconveniente para conseguir la inmunización de animales, decidimos alustar las condiciones para obtener ¡a máxima cantidad de la misma adherida a dicho soporte. En este sentido, como de todas las variables anteriormente señaladas el imidazol era la menos nociva para la

proteína, se decidió realizar los lavados utilizando cantidades crecientes

de imidazol. Finalmente, la unión a la resma de los extractos celulares

obtenidos en células Cos-1 se hizo con él tampón compuesto por 5OmM Tris HCI pH 8; 50 mM CINa; 5mM C12 Mg; 10 % glicerol; 1 % NP4O; 10 mM

imidazol: 1 M hidrocloruro de guanidina, y lavados primero con el tampón

base a 20 mM imidazol y luego a 1 M imidazol y 2 M imidazol. Como

resultado se obtuvo la presencia de la proteína pegada a la resma que se

detectó tanto por Western-Blot como por Coomassie (figura 35>.

Resultados M(KO> 43.9 294 184 ‘9 T ?JA / Lavadas 2OmM IZ 1M IZ \1 2M IZ ~Rs

Figura 35.- Coomassie con los diferentes extractos tomados en la purificación de la proteína codificada por la ORF-5 del PRRS, tras su expresión en células Cos-1. M: marcador de peso molecular; T: totales; NA: no adherido; 20 mM IZ: lavados con un tampón que contiene imidazol a 20 mM; 1M IZ: lavados con un tampón que contiene imidazol a 1M; 2M IZ: lavados con un tampón que contiene imidazol a 2M; Rs: resma.

Con el fin de obtener una mayor producción decidimos realizar la

expresión en células hiela S3 en lugar de en células Cos-1, sin embargo, los niveles de expresión obtenidos fueron considerablemente inferiores en esta línea celular (datos, no mostrados).

2.7. ESTUDIOS DE INMUNOGENICIDAD CON LA PROTEíNA