Quintana Roo, Punta Laguna – El Cuyo

STT Thiết ị, dụng cụ Xuất xứ

1 Sinh hàn hồi lƣu Đức

2 Bình cầu 250 ml, 100 ml Đức

3 Bình phun, ình sắc kí Trung Quốc

4 Bản mỏng silicagel GF₂₅₄ Đức

5 Nhiệt kế thủy ngân Trung Quốc

6 Phễu lọc Buchner Trung Quốc

7 Máy khuấy từ gia nhiệt IKA Đức

8 Máy cất quay Buchi B480 Thụy Sĩ

9 Cân kỹ thuật Sartorius BP2001S Thụy Sĩ

10 Máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt Mỹ

11 Tủ sấy Memmert Đức

12 Máy sấy đèn hồng ngoại Đức

13 Máy đo phổ hồng ngoại Perkin Elmer Mỹ

14 Máy đo phổ hƣởng từ hạt nhân proton (

H-NMR)

Bruker AV-500 Mỹ

15 Máy đo phổ khối lƣợng Agilent 6310 Ion Trap Mỹ

2.2. Nội dung nghiên cứu

– Tổng hợp các dẫn chất acid 2-phenylthiazolidin-4-carboxylic (2a-e), dẫn chất acid 3-tert-butoxycarbonyl-2-phenylthiazolidin-4-carboxylic (3a-d) và dẫn chất acid 3-benzoyl-2-phenylthiazolidin-4-carboxylic (4a-d) có cấu trúc hóa học nhƣ sau:

– Xác định cấu trúc của các chất 3a-d, 4a-d tổng hợp ằng cách đo phổ hồng ngoại, phổ khối lƣợng và phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton.

– Thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm in vitro của các chất 3a-d, thử tác dụng gây độc tế ào của các chất 4a-d

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.1. Tổng hợp hóa học và kiểm tra độ tinh khiết

– Sử dụng các phƣơng pháp tổng hợp hóa học, dựa trên phản ứng:

 Phản ứng đóng vòng tạo acid 2-phenylthiazolidin-4-carboxylic.

 Phản ứng tạo dẫn chất thế ở vị trí N3: N-acyl hóa

– Dùng sắc kí lớp mỏng để theo d i quá trình tiến triển của phản ứng. Soi đèn tử ngoại ở ƣớc sóng 245nm để nhận iết đƣợc vết sắc ký

– Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm ằng SKLM và đo nhiệt độ nóng chảy.

2.3.2. Xác định cấu trúc

Phổ IR: tại phòng phân tích cấu trúc phân tử Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, các chất đã đƣợc ghi phổ hồng ngoại trên máy với kỹ thuật viên nén KBr ghi trong vùng 4000-400cm-1.Các mẫu rắn đƣợc phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ khoảng 1:200 rồi ép dƣới dạng film mỏng dƣới áp lực cao có hút chân không để loại bỏ hơi ẩm [2].

Phổ MS: Máy đo phổ khối lƣợng 1100 Series LC/MSD Trap Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Nguyên tắc chung của phƣơng pháp phổ khối lƣợng là dùng các electron mang năng lƣợng cao bắn phá phân tử hợp chất hữu cơ trung hòa thành các ion phân tử mang điện tích dƣơng hoặc phá vỡ thành các mảnh ion, các gốc. Các ion đƣợc phân tách rồi đƣợc ghi lại tín hiệu theo tỉ số khối lƣợng/điện tích (m/ze) của chúng. Vì xác suất tạo thành ion có z>1 là rất nhỏ và vì điện tích của 1 electron không đổi nên thông thƣờng m/ze chính là khối lƣợng của ion [5].

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) đƣợc ghi trên máy Bruker AV-500 tại Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.3.3. Thử tác dụng sinh học 2.3.3.1. Hoạt tính kháng khuẩn

a. Các chủng vi sinh vật kiểm định do bộ môn Vi sinh - Sinh học, trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội cung cấp.

Vi khuẩn Gram(-)

Escherichia coli ATCC 25922 (EC)

Proteus mirabilis BV 108 (Pro)

Shigella flexneri DT 102 (Shi)

Salmonella typhi DT 220 (Sal)

Pseudomonas aeruginosa VM 201 (P.A)

Vi khuẩn Gram(+)

Staphylococus aureus ATCC 1128 (Sta)

Bacillus pumilus ATCC 10242 (Bp)

Bacillus cereus ATCC 9946 (Bc)

Sarcina lutea ATCC 9341 (SL)

Kháng sinh đối chứng: Streptomycin: 14µg/ml Penicillin: 27 UI/ml

. Môi trƣờng thử nghiệm

 Môi trƣờng canh thang nuôi cấy VK kiểm định:

NaCl 0,5% ; pepton 0,5% ; cao thịt 0,3 % ; nƣớc vđ 100ml. _ Môi trƣờng thạch thƣờng :

NaCl 0,5% ; pepton 0,5% ; cao thịt 0,3 % ; thạch 1,6% ; nƣớc vđ 100ml.

c. Phƣơng pháp thử (Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán). Nguyên tắc: mẫu thử (có chứa hoạt chất thử) đƣợc đặt lên lớp thạch dinh dƣỡng đã cấy VSV kiểm định, hoạt chất từ mẫu khuếch tán vào môi trƣờng thạch sẽ ức chế sự phát triển của VSV kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn.

 Đánh giá dựa trên đƣờng kính vòng vô khuẩn và đƣợc đánh giá theo công thức. 2 1 1 ( ) 1 n n i i i i D D D D s n n      



D: Đƣờng kính trung bình vòng vô khuẩn (mm) i

D

: Đƣờng kính vòng vô khuẩn thứ i (mm)

s : Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh n : số thí nghiệm làm song song (n = 3)

2.3.3.2. Hoạt tính kháng nấm

a. Các chủng VSV kiểm định do bộ môn Vi sinh – Sinh học, trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội cung cấp

Vi Nấm: Candida albicans (Ca) Saccharomyces cerevisiae (Sa) Aspergillus niger (As)

Penicilium sp. (Pe)

. Môi trƣờng kiểm nghiệm

Môi trƣờng Sabouraud lỏng nuối cấy C. albicans: Pepton 1,0% ; glucose 2,0 %; nƣớc vđ 100ml Môi trƣờng thử nghiệm Sabouraud:

Pepton 1,0% ; glucose 2,0 %; thạch 1,6%; nƣớc vđ 100ml

c. Phƣơng pháp thử (Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán) Nguyên tắc: mẫu thử (khoanh giấy lọc đƣợc tẩm hoạt chất thử) đƣợc đặt lên lớp thạch dinh dƣỡng đã cấy VSV kiểm định, hoạt chất từ mẫu thử khuếch tán vào môi trƣờng thạch sẽ ức chế sự phát triển của VSV kiểm định tạo thành vòng vô nấm.

 Đánh giá kết quả: Dựa vào đƣờng kính vòng vô nấm và đƣợc đánh giá theo công thức: 2 1 1 ( ) 1 n n i i i i D D D D s n n      



D: Đƣờng kính trung bình vòng vô khuẩn (mm) i

D

: Đƣờng kính vòng vô khuẩn thứ i (mm)

s : Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh n : số thí nghiệm làm song song (n = 4)

2.3.3.3. Thử tác dụng chống ung thư

Phép thử chống tế ào ung thƣ đƣợc thực hiện tại Phòng sinh học thực nghiệm- Viện hóa học các hoạt chất thiên nhiên- Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam

Phƣơng pháp phân tích: Theo phƣơng pháp của Skehan & CS (1990) và

Likhiwitayawuid & CS(1993) hiện đang đƣợc áp dụng tại Viện nghiên cứu ung thƣ Quốc gia của Mỹ (NCI) và trƣờng đại học Dƣợc, đại học Tổng hợp Illinois,

Chicago, Mỹ. Dòng tế bào

29  Dòng MCF7: Ung thƣ iểu mô vú

Môi trường nuôi cấy tế bào: DMEM (Dul ecco’s Modified Eagle Medium)

hoặc MEME (Minimum Essential Medium with Eagle’s salt)

Có ổ xung L- glutamine, Sodium piruvat, NaHCO3, PSF(Penixillin- Streptomycin sulfate- Fungizone); NAA (Non-Essential Amino Acids); 10% BCS (Bovine Calf Serum)

Tripsin-EDTA 0,05%; DMSO (Dimethyl Sulfoside); TCA(Trichloro Acetic acid); Tris Base; PBS (Phosphate Buffered Saline); SRB (Sulfo Rhodamine B); Acid Acetic.

Các dụng cụ dùng 1 lần: Bình nuôi cấy tế ào, phiến vi lƣợng 96 giếng, pipet

pasteur, các đầu tuýp cho micropipet…

Chất chuẩn chứng dương tính:

Dùng chất chuẩn có khả năng diệt tế ào: Ellipticine, Vin lastine hoặc Taxol pha trong DMSO

- Đọc trên máy ELISA ở ƣớc sóng 495-515nm

Tính kết quả:

Giá trị CS: là khả năng sống sót của tế ào ở nồng độ nào đó của chất thử tính theo % so với đối chứng. Dựa trên kết quả đo đƣợc của chúng OD (ngày 0), DMSO 10% và so sánh với giá trị OD khi trộn mẫu để tìm giá trị CS(%) theo công thức:

OD (mẫu) – OD (ngày 0)

CS% = x 100

OD (DMSO) – OD (ngày 0)

Giá trị CS% sau khi tính theo công thức trên, đựơc đƣa vào tính toán Excel để tìm ra % trung ình ± độ lệch tiêu chuẩn của phép thử đƣợc lặp lại 3 lần theo công thức của Ducan nhƣ sau: Độ lệch tiêu chuẩn 

 (xi - x )2

 =

Các mẫu có iểu hiện hoạt tính (CS < 50%) sẽ đƣợc chọn ra để thử nghiệm tiếp để tìm giá trị IC50

Giá trị IC₅₀ : dùng giá trị CS của 10 thang nồng độ, dựa vào chƣơng trình Ta le curve theo thang gía trị logarit của đƣờng cong phát triển tế ào và nồng độ chất thử để tính giá trị IC50. Công thức: 1/y=a+ lnX

31 CHƢƠNG 3

THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1. Tổng hợp hóa dƣợc

3.1.1. Tổng hợp acid 2-phenylthiazolidin-4-carboxylic và dẫn chất

3.1.1.1. Tổng hợp acid 2-phenylthiazolidin-4-carboxylic (2a)

a. Sơ đồ phản ứng

Hình 3.1: Sơ đồ tổng hợp acid 2-phenylthiazolidin-4-carboxylic và dẫn chất.

b. Cách tiến hành

Hòa tan 3,51g (0,02mol) L-cystein hydroclorid monohydrat trong 16ml nƣớc cất trong bình cầu 3 cổ 100ml sạch, đã đƣợc sục khí N2. Khí N2 đƣợc sục liên tục

trong quá trình phản ứng. Cho dần dần 1,7g (0,02mol) NaHCO₃cho đến khi hết bọt khí sinh ra. Sau đó thêm từ từ 2,2ml (0,02mol) benzaldehyd trong 20ml ethanol tuyệt đối vào dung dịch trên. Tiến hành phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 24h. Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi n- utanol: acid acetic: nƣớc = 9: 2: 2,5. Kết thúc phản ứng lọc lấy tủa, rửa bằng nƣớc và ethanol, sấy khô. Kết tinh lại trong ethanol thu đƣợc chất 2a.

c. Kết quả

– Cảm quan: tinh thể hình kim, màu trắng.

– Lƣợng sản phẩm thô: 4,0g. – Sau kết tinh: m_2a = 3,1g. – Hiệu suất phản ứng: H_2a= 71,8%. – R_f = 0,74. – T0_nc= 160-1620C. 3.1.1.2. Tổng hợp acid 2-(4-clorophenyl)thiazolidin-4-carboxylic (2b) a. Sơ đồ phản ứng b. Cách tiến hành Tiến hành tƣơng tự nhƣ phản ứng tổng hợp chất 2a nhƣng thay 2,2ml chất 1a bằng 2,81g (0,02mol) 4-clorobenzaldehyd (1b). Sản phẩm thô đƣợc kết tinh lại trong hỗn hợp aceton/nƣớc (1/1).

c. Kết quả

– Cảm quan: tinh thể hình kim, màu trắng. – Khối lƣợng sản phẩm: m_2b = 2,28g. – Hiệu suất: H2b = 54,7%. – R_f = 0,71. – T0_nc= 162-1640C. 3.1.1.3. Tổng hợp acid 2-(4-methoxyphenyl)thiazolidin-4-carboxylic (2c) a. Sơ đồ phản ứng b.Cách tiến hành Tiến hành tƣơng tự nhƣ phản ứng tổng hợp chất 2a nhƣng thay 2,2ml chất 1a bằng 2,43ml (0,02mol) 4-methoxybenzaldehyd (1c). c. Kết quả – Cảm quan: bột kết tinh trắng. – Khối lƣợng sản phẩm: m2c = 3,8g. – Hiệu suất: H_2c = 79,5%. – R_f = 0,75. – T0 nc = 166-1700C. 3.1.1.3. Tổng hợp acid 2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)thiazolidin-4-carboxylic (2d) a. Sơ đồ phản ứng b. Cách tiến hành Tiến hành tƣơng tự nhƣ phản ứng tổng hợp chất 2a nhƣng thay 2,2ml chất 1a bằng 3,1g (0,02mol) vanillin (1d).

c.Kết quả

– Cảm quan: bột kết tinh màu trắng. – Khối lƣợng sản phẩm: m_2d = 3,5g.

– Hiệu suất phản ứng: H2d= 68,6%.

– R_f = 0,73.

– T0_nc= 168-1700C.

3.1.1.5. Tổng hợp acid 2-(2-clorophenyl)thiazolidin-4-carboxylic (2e)

a. Sơ đồ phản ứng

b. Cách tiến hành

Tiến hành tƣơng tự nhƣ phản ứng tổng hợp chất 2a nhƣng thay 2,2ml chất 1a bằng 2,81g (0,02mol) 2-clorobenzaldehyd (1e).

c. Kết quả

– Cảm quan: bột kết tinh màu trắng. – Khối lƣợng sản phẩm: m_2c = 2,51g. – Hiệu suất: H2c = 60,2%. – R_f = 0,70. – T0nc = 185-1870C 3.1.2. Tổng hợp acid 3-tert-butoxycarbonyl-2-phenylthiazolidin-4-carboxylic và dẫn chất

3.1.2.1. Tổng hợp acid 3-tert-butoxycarbonyl-2-phenylthiazolidin-4-carboxylic (3a)

a. Sơ đồ phản ứng

b. Cách tiến hành

Cho 4,5ml NaOH 1N vào hỗn hợp gồm 1,0g (4,78mmol) chất 2a và 8ml THF vào bình phản ứng 100ml ở nhiệt độ phòng. Khuấy đến tan hoàn toàn khoảng 10 phút, sau đó thêm từ từ dung dịch gồm 1,1ml (4,78mmol) Boc2O trong 4ml THF.

Sau khi khuấy ở nhiệt độ phòng trong 18h, hỗn hợp phản ứng đƣợc rửa bằng ether, sau đó acid hóa ằng HCl 18% tới pH 1 và chiết bằng ether. Dịch chiết ether đƣợc rửa bằng nƣớc, làm khan bằng Na2SO4 khan. Cất quay loại dung môi thu đƣợc chất

rắn màu trắng và tiến hành kết tinh lại trong n-hexan/ether thu đƣợc 3a.

Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng SKLM với hệ methanol: n-Hexan = 7: 3.

c. Kết quả

Cảm quan: tinh thể hình lăng trụ, màu trắng. – Khối lƣợng sản phẩm: m3a = 0,81g. – Hiệu suất: H_3a = 54,7%. – R_f = 0,60. – T0nc = 170-1740C. 3.1.2.2. Tổng hợp acid 3-tert-butoxycarbonyl-2-(4-clorophenyl)thiazolidin-4- carboxylic (3b) a. Sơ đồ phản ứng b. Cách tiến hành

Tiến hành tƣơng tự nhƣ phản ứng tổng hợp chất 3a với các nguyên liệu sau: – 1,0g (4,1mmol) acid 2-(4-clorophenyl)thiazolidin-4-carboxylic (2b) trong 8ml

THF.

– 4,2ml dung dịch NaOH 1N.

c. Kết quả

– Cảm quan: tinh thể hình lăng trụ, trong suốt. – Khối lƣợng sản phẩm: m_3b = 0,9g. – Hiệu suất: H3b = 63,8 %. – R_f = 0,54. – T0_nc= 176-1780C. 3.1.2.3. Tổng hợp acid 3-tert-butoxycarbonyl-2-(4-methoxyphenyl)thiazolidin-4- carboxylic (3c) a. Sơ đồ phản ứng b. Cách tiến hành

Tiến hành tƣơng tự nhƣ phản ứng tổng hợp chất 3a với các nguyên liệu: – 1,0g (4,18mmol) acid 2-(4-methoxyphenyl)thiazolidin-4-carboxylic (3c) trong

8ml THF.

– 4ml dung dịch NaOH 1N.

– 1ml Boc2O trong 4ml THF.

c. Kết quả

– Cảm quan: tinh thể hình lăng trụ, màu trắng. – Khối lƣợng sản phẩm: m_3c= 0,82 g. – Hiệu suất: H_3c = 58,1 %. – Rf = 0,63. – T0 nc = 180-1850C. 3. 1.2.4. Tổng hợp acid 3-tert-butoxycarbonyl-2-(4-hydroxy-3- methoxyphenyl)thiazolidin-4-carboxylic (3d) a. Sơ đồ phản ứng

b. Cách tiến hành

Tiến hành tƣơng tự nhƣ phản ứng tổng hợp chất 3a với các nguyên liệu:

– 1,0g (3,92mmol) chất acid 2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)thiazolidin-4-

carboxylic (2d) trong 8ml THF.

– 4,0ml dung dịch NaOH 1N.

– 1ml Boc₂O/4ml THF.

c. Kết quả

– Cảm quan: bột tinh thể màu trắng. – Khối lƣợng sản phẩm: m_3d = 0,7g. – Hiệu suất: H3d = 50,3%.

– R_f = 0,47.

– T0_nc= 167-1700C.

3.1.3. Tổng hợp acid 3-benzoyl-2-phenylthiazolidin-4-carboxylic và dẫn chất

3.1.3.1. Tổng hợp acid 3-benzoyl-2-phenyl thiazolidin-4-carboxylic (4a)

a. Sơ đồ phản ứng

. Tiến hành

Cho vào ình cầu dung tích 100ml 30,0ml dung dịch NaOH 1N, làm lạnh ên ngoài ằng nƣớc đá xuống <100

C. Thêm 0,63g (0,003 mol) acid 2- phenylthiazolidin-4-carboxylic 2a vào, khuấy cho tan hết, vẫn duy trì nhiệt độ

<100C, thêm 25,0 ml tert- utanol vào khối phản ứng. Sau đó vừa khuấy vừa cho dần 0,0035 mol enzoyl clorid vào hỗn hợp phản ứng. Hỗn hợp sau đó đƣợc khuấy thêm 10h ở nhiệt độ phòng, acid hóa hỗn hợp phản ứng ằng dung dịch HCl 1M đến pH 1. Sau đó, chiết hỗn hợp phản ứng 3 lần với ethyl acetat (mỗi lần khoảng 15ml), pha

hữu cơ sau đó đƣợc rửa ằng nƣớc muối ão hòa, làm khan ằng Na2SO4 khan, cất

loại dung môi thu đƣợc cắn. Cắn này sau đó đƣợc hòa tan trong 15 ml EtOH tuyệt đối, để lạnh qua đêm thu đƣợc hợp chất acid 3-benzoyl-2-phenylthiazolidin-4-

carboxylic (4a). Kết tinh lại trong methanol.

Theo d i phản ứng ằng SKLM với hệ dung môi CH2Cl2: MeOH = 4: 1

c. Kết quả phản ứng

 Cảm quan: Bột kết tinh màu trắng

 Khối lƣợng sản phẩm: m4a= 0,58g

 Hiệu suất: H = 61,2%

 Nhiệt độ nóng chảy: T0

nc = 133-1350C

 R_f = 0,5

3.1.3.2. Tổng hợp acid 3-benzoyl-2-(4-clorophenyl) thiazolidin-4-carboxylic (4b)

a. Sơ đồ phản ứng

. Tiến hành

Tiến hành tƣơng tự nhƣ phản ứng tổng hợp chất 4a với nguyên liệu nhƣ sau:

 30ml dung dịch NaOH 1N

 0,73g (0,003mol) acid 2-(4-clorophenyl) thiazolidin-4-carboxylic (2b)

 25ml tert-butanol

 0,0035mol benzoyl clorid

c. Kết quả phản ứng

39  Khối lƣợng sản phẩm: m4b= 0,57g  Hiệu suất H = 54,7%  Nhiệt độ nóng chảy: T0_nc = 174-1750C  Rf = 0,4 3.1.3.3. Tổng hợp acid 3-benzoyl-2-(4-methoxyphenyl)thiazolidin-4-carboxylic (4c) a. Sơ đồ phản ứng . Tiến hành

Tiến hành tƣơng tự nhƣ phản ứng tổng hợp chất 4a với nguyên liệu nhƣ sau:

 30ml dung dịch NaOH 1N

 0,72g (0,003mol) acid 2-(4- methoxyphenyl)thiazolidin-4-carboxylic (2c)

 25ml tert-butanol

 0,0035mol benzoyl clorid

c. Kết quả phản ứng

 Cảm quan: Bột kết tinh màu trắng

 Khối lƣợng sản phẩm:m4c= 0,7g  Hiệu suất H = 69,2%  Nhiệt độ nóng chảy: T0_nc = 92-940C  R_f = 0,56 3.1.3.4. Tổng hợp acid 3-benzoyl-2-(2-clorophenyl)thiazolidin-4-carboxylic (4d) a. Sơ đồ phản ứng

. Tiến hành

Tiến hành tƣơng tự nhƣ phản ứng tổng hợp chất 4a với nguyên liệu nhƣ sau:

 30ml dung dịch NaOH 1N

 0,73g (0,003mol) acid 2-(2-clorophenyl)thiazolidin-4-carboxylic (2e)

 25ml tert-butanol

 0,0035mol benzoyl clorid

c. Kết quả phản ứng

 Cảm quan: Bột kết tinh màu trắng

 Khối lƣợng sản phẩm: m4d= 0,71g

 Hiệu suất H = 68,3%

 Nhiệt độ nóng chảy: T0nc = 189-1910C

 Rf = 0,45

3.1.4. Tóm tắt kết quả tổng hợp đƣợc

Các chất thu đƣợc sau tổng hợp hóa học đƣợc trình ày tóm tắt tại ảng 3.1.

Bảng 3.1: Tóm tắt kết quả các dẫn chất tổng hợp đƣợc

In document Estudio de factibilidad para la creación de un proyecto de ecoturismo basado en el ciclismo y senderismo de naturaleza en la Península de Yucatán (página 51-68)

Quintana Roo, Punta Laguna – El Cuyo – Chiquilá





D





D