Rápido análisis de ligandos que interaccionan selectivamente

Resumen

Muchas de las terapias dirigidas se basan en la diversidad molecular de la superficie celular. La caracterización de las moléculas de superficie de los distintos tipos celulares es de gran ayuda para el diseño de terapias dirigidas. Los intentos previos para estudiar esta diversidad usando genotecas fágicas han resultado dificultosos, debido principalmente a que los fagos se han incubado en células en suspensión o en cultivos monocapa. En estas condiciones los lavados de los bacteriófagos unidos inespecíficamente producen la pérdida de la mayor parte de los ligandos específicos.

Con el propósito de mejorar las técnicas actuales de caracterización de moléculas de superficie basadas en la selección de ligandos celulares específicos hemos desarrollado una nueva metodología que nos permite aislar ligandos de una manera más eficiente tanto evitando la pérdida de potenciales ligandos como incrementando la selección de aquellos que tienen baja afinidad. Esta nueva técnica se basa en la distinta solubilidad que presenta el fago unido a las células respecto al fago libre. Para ello, se resuspenden las células de interés en medio con BSA (albúmina sérica bovina) y se incuban con la genoteca bacteriofágica. Este proceso se desarrolla a cuatro grados para minimizar las uniones posteriores o la internalización de los receptores. El conjunto se transfiere a una solución orgánica no-micelable, se somete a centrifugación e inmediatamente se introduce al nitrógeno líquido para que las fases orgánicas queden separadas. La parte inferior del tubo que contiene el precipitado celular y el fago unido a la superficie de las células, se corta y se transfiere a un nuevo tubo. El fago que no se ha unido a las células permanece soluble en la fase acuosa superior, debido a que la fase orgánica es hidrofóbica, y excluye los materiales solubles en agua. De esta forma con una simple centrifugación se evita una serie de múltiple lavados para descartar el fago que no se ha unido a la superficie celular.

Esta nueva tecnología se aplicó con el fin de aislar péptidos que se unieran a receptores de la superficie de las células endoteliales. Nuestro interés se centró en aislar de manera específica ligandos que reconocieran receptores de la célula endotelial una

vez estimulada con el factor de crecimiento VEGF (vascular endothelial growth factor). Para ello en primer lugar se incubó una genoteca bacteriofágica con las células endoteliales no estimuladas y se recuperó la fase acuosa con el fago no unido a las células. De esta manera se descartan todos los fagos que se unen a receptores que se expresan de manera constitutiva. El fago recuperado en el paso anterior se añadió a un cultivo de células endoteliales estimuladas con el VEGF y se siguió el proceso de selección de bacteriófagos descrito anteriormente. Después de dos rondas adicionales de selección siguiendo el mismo proceso, se secuenciaron al azar los insertos de 34 clones de los cuales se escogieron 21 para comprobar que la unión era específica de las células endoteliales estimuladas con VEGF. Se

encontró que estos clones tuvieron mayor

especificidad de unión a las células endoteliales previamente estimuladas con VEGF que a aquellas que no lo habían sido.

El alineamiento de las secuencias peptídicas de los 34 clones seleccionados al azar mostraron que el 70% de ellos tenían motivos peptídicos presentes en la secuencia proteica de la familia del VEGF. Seleccionamos el péptido CPQPRPLC para su estudio y posterior caracterización ya que compartía una secuencia común con tres fagos aislados en el mismopanning. Se observó que este péptido se unía a dos miembros de la familia del VEGF receptor, el VEGFR1 (VEGF receptor 1) y el NRP-1 (neuro- pilin-1), siguiendo un patrón de reconocimiento similar al usado por VEGF-B. Así mismo VEGF165 inhibía la unión del fago al receptor, confirmando los estudios previos que mostraban competición por la unión al receptor del VEGF165y el VEGF-B. La especificidad de la unión del fago al receptor se confirmó debido a que dicha unión era inhibida por el péptido sintético expresado en la secuencia bacteriofágica.

Nuestros resultados sugieren que el péptido CPQPRPLC mimetiza a la familia del VEGF-B e interacciona específicamente con el VEGFR-1 y NRP-1. Estos resultados muestran que esta nueva metodología puede ser de gran valor para aislar pares de ligandos-receptores en poblaciones

Extracellular matrix proteins and receptors in apoptosis

celulares. La diversidad de aplicaciones de este nuevo método para el uso en las células provenientes de pacientes abre las puertas a muchas aplicaciones

clínicas, como podría ser la investigación de marcadores en células leucémicas o combinaciones con aspirados de tumores sólidos.

Results

Here we introduce a new approach for the screening, selection and sorting of cell-surface–binding peptides from phage li- braries. Biopanning and rapid analysis of selective interactive ligands (termed BRASIL) is based on differential centrifugation in which a cell suspension incubated with phage in an aqueous upper phase is centrifuged through a non-miscible organic lower phase. This single-step organic phase separation is faster, more sensitive and more specific than current methods that rely on washing steps or limiting dilution. As a proof-of-principle, we screened human endothelial cells stimulated with vascular en- dothelial growth factor (VEGF) and constructed a peptide-based ligand-receptor map of the VEGF family. Next, we validated the motif PQPRPL as a novel chimeric ligand mimic that binds specif- ically to VEGF receptor-1 and to neuropilin-1. BRASIL may prove itself a superior method for probing target cell surfaces with a broad range of potential applications.

Probing the molecular diversity of cell surfaces is required for the development of targeted therapies1_{. However, selections of}

phage libraries on cell surfaces are often challenging experi- ments. First, non-specific clones are recovered when phage li- braries are incubated with cell suspensions or monolayers. Second, removal of background by repeated washes is both labor-intensive and inefficient. Third, cells and potential ligands are lost during the washing steps required.

To address these obstacles, we devised a method termed