R2.1.6.1 La sobreexpresión de aPKC-CA reduce los niveles de Expanded y afecta a su localización subcelular
Expanded (Ex) es un regulador positivo de la vía de SWH que por un lado interviene en la fosforilación e inactivación de Yki por Warts (Hamaratoglu et al., 2006) de un modo cooperativo junto a Merlin y Kibra (Baumgartner et al., 2010; Genevet et al., 2010; Yu et al., 2010) y por otro controla la actividad de Yki, mediante interacción directa proteína- proteína reclutándolo al dominio apical (Badouel et al., 2009; Oh et al., 2009).
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Ex se localiza en la región apical de las células epiteliales (es decir, en el dominio de la membrana plasmática donde se encuentran aPKC y Crb, Figura R24 A) y su correcta localización asegura la funcionalidad de la vía SWH. Resultados previos indican que la localización subcelular y los niveles de Ex en el disco de ala dependen de la actividad del gen crb. Así en mutantes de falta de función de crb, Ex deja de localizarse en el dominio apical para encontrarse disperso en el citoplasma. Por otro lado, la sobreexpresión del dominio intracelular de Crb (Crb-intra) causa la eliminación de Ex. En ambos casos, la vía de SWH se inactiva y el disco de ala sobrecrece (Chen et al., 2010; Ling et al., 2010; Robinson et al., 2010; Ribeiro et al., 2014).
Dada la estrecha relación física y funcional entre aPKC y Crb (Sotillos et al., 2004) nos preguntamos si la expresión de aPKC-CA podría modificar la localización subcelular y/o los niveles de Ex. Observamos que los niveles de Ex en la membrana apical disminuían y su localización se hacía más difusa conforme aumentaba el tiempo de exposición de las células a aPKC-CA (Figura R24, B, C). Estos efectos dependen de la actividad quinasa de aPKC y no de posibles funciones estructurales de aPKC ya que la sobreexpresión de la proteína mutante aPKC-DN no los causa (Figura R24 D).
Como los niveles transcripcionales de expanded (medidos por la expresión de ex-LacZ) están aumentados en discos en-Gal4, UAS- aPKC-CA(Figura R18 B) estos resultados sugieren que la sobreexpresión de aPKC-CA regula a Ex a nivel post-transcripcional. Al contrario que en el disco de ala, se ha descrito que la sobreexpresión de aPKC-CA en el disco de ojo controlada por la línea GMR-Gal4 no altera la localización de Ex (Grzeschik et al., 2010), lo que sugiere que el efecto de aPKC sobre Ex es específico de tejido.
Realizamos el experimento complementario, es decir, analizamos si la sobreexpresión de ex en discos en> aPKC-CA podría revertir su fenotipo. El sobrecrecimiento de los discos de ala mutantes aPKC-CA se reduce en parte al suplementar Ex de modo exógeno, indicando que la cantidad de Ex era limitante en los discos aPKC-CA (Figura R23 H-I’).
RESULTADOS
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R2.1.6.2 Expanded como posible diana de fosforilación de aPKC.
Nuestros resultados indican por tanto que la sobreexpresión de aPKC-CA causa la bajada de niveles y la deslocalización de Ex; y la inactivación de la vía de SWH en el disco de ala. Previamente Chen et al., (2010); Ling et al., (2010) y Robinson et al., (2010) habían demostrado que la sobreexpresión del dominio intracelular de Crb (Crb intra) o su falta de función afectan a la localización y niveles de Ex; y que Crb, mediante su dominio FERM, recluta a Ex a la membrana apical, donde es fosforilado por una quinasa desconocida por el momento. En experimentos realizados in vitro en cultivos de células de Drosophila S2R+ se vio cómo la localización en la membrana de Ex dependiente de Crb favorece esta fosfo- rilación (Ling et al., 2010; Ribeiro et al., 2014). Dada la interacción física de Crb y aPKC (Sotillos et al., 2004), nos preguntamos si Ex unido a Crb sería un sustrato de fosforilación por aPKC. De hecho, el programa de predicción de fosforilación de proteínas Net phosk 1.0 sugería que Ex podría ser fosforilado por la familia de proteínas PKCs (Anexo 3).
Figura R24. La sobreexpresión de aPKC-CA altera la localización subcelular de Expanded. Se muestran cortes sagitales de discos de ala teñidos con anticuerpo anti-Ex. (A)
Localización de Ex en un disco de ala de tipo silvestre en la región subapical. (B- C’) Discos mutantes en-Gal4 UAS-aPKC-CA teñidos con anti-Ex después de 24 o 48 horas de sobreexpresión de aPKC-CA a 25 ºC. Ex se deslocaliza y baja de niveles progresivamente en el compartimento posterior mutante (marcado por la expresión de GFP, su límite anterior se señala por la línea roja en B’ y C’). (D, D’) La localización de Ex no se altera al sobreexpresar UAS-aPKC-DN.
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Para responder a esta pregunta obtuvimos del Dr. D.J. Pan dos plásmidos que permiten la expresión de Expanded-V5 y Expanded-V5-miristoilado y dirigido a membrana (Ling et al., 2010). Según describieron estos autores, cuando Expanded se localizada en la membrana plasmática (ya sea por unión a Crb o por una señal de miristoilación) se fosforila, visualizándose una menor movilidad electroforética frente a la de esta misma proteína en ausencia de Crb-intra, desprovista de una señal de miristoilación o después del tratamiento con la fosfatasa CIP (Ling et al., 2010). Si la fosforilación de Ex dependiera de aPKC, inhibiendo esta quinasa, la banda proteica correspondiente a Expanded podría experimentar un cambio en su movilidad electroforética similar al obtenido por tratamiento con la fosfatasa CIP. Comprobamos que aPKC se encuentra activa en células S2R+ mediante tinción de Western blots con el anticuerpo anti p-T555 aPKC (Figura R25 A) y que Expanded-V5-miristoilado presenta una movilidad electroforética ligeramente menor que Expanded-V5 y sensible al tratamiento con CIP (Figura R25 B) lo que indica su estado fosforilado. Sin embargo, dicha fosforilación no parece depender de aPKC ya que la movilidad electroforética de Expanded-V5-miristoilado no se modifica por el tratamiento de las células con el inhibidor de PKCs chelerytrine (Figura R25 B).
Por tanto estos resultados sugieren que aPKC no es la enzima que fosforila a Ex en el dominio apical de la membrana.
Figura R25. aPKC no parece ser la quinasa responsable de la fosforilación de Ex (A)
Las células S2R+ presentan aPKC fosforilada y por tanto activa. Western blots de proteínas procedentes de extractos de células S2R+ incubados con el anticuerpo anti-pT555 aPKC. Se observa una banda de p-aPKC cuya intensidad disminuye por el tratamiento con la fosfatasa CIP. La transfección con pAc-aPKCCAAX se empleó como control positivo. (B) Western blot de
proteínas procedentes de extractos de células S2R+ transfectadas con las plásmidos de expresión que se indican, tratadas o no con CIP o Chelerytrine e incubados con anti-V5-HRP o anti-aPKC. El punto indica la proteína Ex fosforilada. El gran tamaño de la proteína Ex (160 kD) es probablemente la causa del pequeño cambio de movilidad electroforética asociado a su fosforilación.